發作性運動誘發性運動障礙患者PRRT2基因突變的研究 ①

朱金玲，張游俠，孫 權，頓圓圓，金紹靜

(佳木斯大學基礎醫學院,黑龍江 佳木斯 154007)

發作性運動誘發性運動障礙(Paroxysmal Kinesigenic Dyskinesia, PKD)(MIM 128200)是發作性運動障礙(Paroxysmal dyskinesia)中的最常見的一種，是唯一已知的以休息時突然運動(如開始行走或從坐姿上升)引起的單側或雙側不自主運動為特征的疾病,大多在兒童或青年期發病，發作時以異常運動或異常姿勢改變為特征，如肌張力障礙、舞蹈樣動作、手足徐動和投擲樣動作等，每次持續時間較短，一般在一分鐘以內。PKD發病具有高度異質性，大部分研究認為與遺傳有關，隨著分子生物學技術的發展，2011年,Wang等人[1,2]克隆了富含脯氨酸的跨膜蛋白2(Proline-rich transmembrane protein2，PRRT2)基因，并發現該基因是嬰兒驚厥性陣發性運動誘發運動障礙(PKD/IC)的主要致病基因。有研究發現PRRT2基因突變與良性家族性嬰兒癲癇和熱驚厥相關癲癇、偏癱性偏頭痛和陣發性共濟失調有關[3,4]。最近有研究報道PRRT2與突觸小體相關蛋白SNAP25相互作用,可能參與神經遞質的釋放,影響突觸傳遞[5],但其發生機制有待于進一步研究。PRRT2在中國、日本、亞洲、非洲和高加索人群體中被描述為PKD、PKD/IC和BFIE的致病基因。我們的目的是評估中國人群中發作性運動誘發性運動障礙患者的PRRT2基因突變，為研究發作性運動誘發運動障礙的發病機制提供理論基礎。

1 資料及方法

1.1 研究對象

收集2016～2020年佳木斯中心醫院癲癇科就診的患者散發病例14例，所有患者均為新病例，根據2004年Bruno等[6]提出的診斷標準進行診斷。30例健康對照組為體檢中心提供。

1.2 引物設計

在Nucleotide數據庫中檢索PRRT2 人類DNA序列，選取外顯子2的全序列，用Primer-Blaster在線設計引物，通過PCR實驗篩選出擴增效率較好的一對引物，引物序列如下 ：正向引物為CCAGAAACCACAGAGACCCC，反向引物為TAAGCGAAGGCCACGATGTT，擴增片段長度為665bp，引物序列送上海生工合成。

1.3 DNA 提取

北京百泰克生物技術有限公司全血基因組DNA提取試劑盒提取患者和正常人的基因組DNA(按說明書操作)，提取的DNA放4℃冰箱保存備用。

1.4 PCR 擴增

PCR反應體系:10μL的2×Power Taq PCR Master Mix，正向引物和反向引物各1μL，1μL的DNA模板， 12μL 的dH2O總體積為25μL。 PCR反應條件: 95℃ 預變性5min, 95℃變性45秒、58℃復性30秒、72℃延伸30秒、 30個循環， 最后延伸72℃C，5min，擴增產物長度665bp。

1.5 擴增產物凝膠電泳、純化和測序

PCR擴增產物在2% 的瓊脂糖進行凝膠電泳30min，EB染色，紫外燈下觀察，根據DNA-Marker切取目的DNA部分的凝膠,然后用DNA純化試劑盒純化DNA，純化后的DNA送上海生工測序。

1.6 測序分析

測得的序列應用Blaster在 GeneBank 數據庫中與人類基因組中野生型PRRT2的 mRNA序列 (NM_145239.3)進行序列比對，并根據測序結果圖找到突變位點，突變位點在SNP數庫中找不到的為新發現突變點。

2 結果

14例患者中有5例患者檢測到有熱點突變c.846-847 insC (p.P217fsX)(見圖1)，其中有一個患者同時攜帶有一個基因突變為c.906G>A (p.Glys237Arg)(見圖2)；其余9個患者均檢測到突變位點c.882G>A (p.Arg229 Lys)(見圖3)，該突變為新發現基因突變，這9個患者中有5個患者同時攜帶有c.609C>G (p.Pro138Ala)突變(見圖4)，30例正常人均沒有發現突變。

圖1 c.846-847 insC (p.P217fsX)突變

圖2 c.906G>A (p.Glys237Arg)突變

圖3 c.882G>A (p.Arg229 Lys)

圖4 c.609C>G (p.Pro138Ala)

3 討論

PKD是陣發性運動障礙中最常見的類型，也稱為發作性運動誘發性舞蹈手足徐動癥，是一類反復發作的非自主性運動障礙疾病，PKD在人群中發病率較低，占世界人口的1/15萬。 PKD 常于兒童或青少年期發病，發病具有高度異質性，大多為原發性，有遺傳家族史的病例約占60%，其遺傳方式大多為常染色體顯性遺傳。根據人類基因突變數據庫(The Human Gene Mutation Database，HGMD)，截止到2018年2月，已報道的PRRT2基因突變總計93種[7]。PRRT2基因編碼由N端胞外結構域和C-胞質結構域組成的跨膜蛋白，在腦中高表達。 PRRT2基因 突變是PDK的致病因素，該基因定位于16p11.2-q12.1區帶，該區域編碼離子通道蛋白。最近有研究報道PRRT2與突觸小體相關蛋白SNAP25相互作用,可能參與神經遞質的釋放,影響突觸傳遞[5],進而影響腦功能的改變。PKD與癲癇可能有共同的生物學基礎，其病理生理機制之一很可能與離子通道缺陷有關。少數繼發性PKD可見于多發性硬化癥或腦梗死，還有腦外傷、產期缺氧性腦病、糖尿病、低血糖、甲亢等也可以引發PKD的發生。該病經常被誤診為癲癇，因小劑量抗癲癇藥物治療有效，如卡馬西平、奧卡西平、苯妥英鈉、拉莫三嗪等均能減少或終止發作。

臨床觀察證實原發性PKD是受遺傳因素強烈影響的神經發育障礙性疾病。自PRRT2基因被證實為家族性PKD的致病基因以來，迄今為止在PKD患者中已發現約30種PRRT2基因突變。我們對14例PKD 患者PRRT2基因第2外顯子進行測序，發現1個移碼突變和3個錯義突變。其中c.846-847 insC (p.P217fsX)為熱點突變，c.882G>A (p.Arg229 Lys)為新發現的突變，在SNP基因組數據庫中未檢測到。且14例散發病例中有9例攜帶有此突變(64.3%)，所發現的突變在健康人中均沒有發現，為此我們推測p.Arg229 Lys突變可能是PKD的致病基因，但其發病機制有待于進一步研究。我們的研究結果發現有些患者攜帶有雙重突變，有研究報道PRRT2基因雙重突變可導致智力缺陷[8]，該研究推測PRRT2突變患者的表型差異可能取決于PRRT2突變類型。我們下一步將研究患者的臨床表型與突變之間的關系。

總之我們的研究發現了一個新的點突變,擴大了PKD發病的基因譜,為陣發性運動障礙疾病的診斷提供了新的檢測突變點。