8種微生物源藥劑對葡萄苗圃根結線蟲病的防治

李嘉泓，杜 娟，顧沛雯，張 樂，趙 楠，何金柱

(1.寧夏大學 農學院，銀川 750021；2.楊凌翔林農業生物技術有限公司，陜西楊凌 712100；3.寧夏農墾玉泉營農場有限公司，銀川 750104)

根結線蟲(Meloidogynespp.)是世界上危害最嚴重的植物病原線蟲，寄主范圍廣泛，為害嚴重[1]，一般減產10%～30%，嚴重時可達70%以上，嚴重制約蔬菜、糧食、果樹及觀賞作物的優質高產[2]。寧夏是中國生產優質釀酒葡萄的最佳生態區之一，近年來，隨著葡萄種植面積的擴大和種植年限的延長，葡萄根結線蟲病害在寧夏各產區呈蔓延趨勢，尤其在葡萄育苗圃中發生嚴重，對葡萄苗木生產造成嚴重威脅[3]，已成為制約寧夏葡萄產業可持續發展的一大障礙。

根結線蟲病為典型的土傳病害，生產上多以化學藥劑防治為主，但化學藥劑會造成土壤污染和誘導線蟲產生抗藥性等問題，因此生物防治成為防治根結線蟲病的最佳策略之一。芽胞桿菌(Bacillus)是細菌型生防藥劑中最重要的一類，在防治根結線蟲方面具有良好效果[4]。2011年，梁建根等[5]發現巨大芽胞桿菌(B.megaterium)發酵液對南方根結線蟲(M.incognita)2齡幼蟲有一定毒殺作用，校正死亡率為70.8%，在室內盆栽的防治效果為47.8%。2015年，席先梅等[6]發現蠟質芽胞桿菌(B.cereus)水劑對設施黃瓜、番茄根結線蟲具有良好的防治效果，防效達 56.3%。2019年，D’Errico等[7]研究發現早春或早秋在番茄作物上施用堅強芽胞桿菌(B.firmus)，可抑制根結線蟲的種群密度，促進番茄作物生長。淡紫擬青霉(Purpureocilliumlilacinum)作為一種線蟲內寄生性真菌，是目前生產上廣泛應用的殺線蟲藥劑。2014年，陸然等[8]研究發現淡紫擬青霉(P.lilacinum)對根結線蟲卵孵化的相對抑制率達96.67%，并對根結線蟲2齡幼蟲具有較好的毒殺效果。2019年，Ahmed等[9]發現施用淡紫擬青霉(P.lilacinum)后，85%的根結線蟲卵會被寄生，減少了根結線蟲的侵染為害，促進番茄植株的生長。

本研究以寧夏玉泉營鎮葡萄苗圃內根結線蟲病為對象，在系統調查苗圃內根結線蟲病危害的情況下，通過室內毒力測定和苗圃防效試驗測定7種芽胞桿菌(Bacillus)和1種淡紫擬青霉(P.lilacinum)對葡萄根結線蟲的毒殺效果，以期為葡萄苗圃根結線蟲病害的生物防治提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試植物：2019年5-10月在寧夏玉泉營鎮農墾集團感染根結線蟲病的葡萄育苗基地生產區采集葡萄苗木，葡萄苗齡為1 a生，葡萄品種包括‘赤霞珠’‘霞多麗’‘西拉’‘品麗珠’‘黑比諾’‘梅鹿輒’‘馬瑟蘭’‘陽光玫瑰’‘夏黑’‘愛神玫瑰’‘大青’‘無核翠寶’‘紅芭拉蒂’‘貝達’和‘抗砧3號’。

供試蟲源：從葡萄品種陽光玫瑰幼苗根系中獲得。先解剖根系的根結組織獲得卵囊，將卵囊置于無菌水中，24 ℃恒溫培養箱中孵化2～5 d，獲取2齡幼蟲，經鑒定為南方根結線蟲(M.incognita)，用于室內防效試驗。

供試藥劑：100億cfu/g側孢芽胞桿菌可濕性粉劑、100億cfu/g枯草芽胞桿菌可濕性粉劑、100億cfu/g解淀粉芽胞桿菌可濕性粉劑、100億cfu/g地衣芽胞桿菌可濕性粉劑、100億cfu/g巨大芽胞桿菌可濕性粉劑、50億cfu/g膠凍芽胞桿菌可濕性粉劑和50億cfu/g蠟樣芽胞桿菌可濕性粉劑，江蘇綠科生物技術有限公司產品，推薦用量均為1～2 kg/667m2；100億cfu/g淡紫擬青霉可濕性粉劑，山東諾杰生物科技有限公司，推薦用量為200～400 g/667m2；5%噻唑膦微乳劑，山東綠德地生物科技有限公司，推薦用量為1 250～1 500 mL/667m2；1.8%阿維菌素乳油，上海悅聯化工有限公司，推薦用量為500 mL/667m2；25%復合氨基酸，江蘇漢菱肥業有限責任公司。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄苗圃根結線蟲病癥狀及嚴重度調查 2019年5月，調查苗圃內15個葡萄品種根結線蟲病害的發生情況，每個葡萄品種劃分為3個樣區，樣區面積為10 m2(1 m×10 m)，樣區內苗木數為70～80株，在每個樣區中均按照隨機取樣的原則采集5株苗木，共采集225株葡萄苗木。依據拔根百分法[10]統計嚴重度，計算病情指數。嚴重度分級標準：0 級，根系無根結；1 級，根系1%～10%有根結；2 級，根系 11%～25%有根結；3級，根系 26%～50%有根結；4 級，根系 51%～75%有根結；5 級，根系 76%以上有根結。

病情指數=∑(各級病株數×該病級值)/(調查總株數×最高級值)×100

1.2.2 葡萄根結線蟲病室內毒力測定 按藥劑說明書，配置活化芽胞桿菌和淡紫擬青霉孢子粉的營養液(含0.001%紅糖和0.01%復合氨基酸)。分別稱取100 g側孢芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、淡紫擬青霉孢子粉及200 g膠凍芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌孢子粉，溶解在1 L營養液中，30 ℃孵育12 h，用于激活菌劑。吸取搖勻菌液，按照稀釋平板法[11]檢測有效活菌數。依據活菌數將8種菌劑分別配置成有效孢子濃度為1.0×109cfu/mL的母液。用營養液稀釋成孢子濃度為 1.0×108、5.0×107、2.5×107、1.25×107和 6.25×106cfu/mL梯度溶液，阿維菌素和噻唑膦依推薦用量分別配置為16.7 mg/L和50 mg/L的溶液。

采用程永等[12]直接觸殺法進行室內毒力測定。具體操作如下：在96孔板酶標板(無錫國盛生物工程有限公司)上，每孔加入150 μL藥液和10只活躍的2齡幼蟲。每種藥劑按孢子濃度設5組處理，每處理重復9次，另設阿維菌素和噻唑膦為陽性對照，清水為陰性對照。孵育在24 ℃恒溫培養箱中，每隔12 h在光學顯微下觀察2齡幼蟲的存活情況，持續觀察4 d，計算校正死亡率。并拍照各藥劑處理后2齡幼蟲致死癥狀。

校正死亡率=(處理死亡率-清水對照死亡率)/(1-清水對照死亡率)×100%

1.2.3 葡萄苗圃根結線蟲病防效試驗 2019年10月于寧夏玉泉營鎮葡萄育苗基地生產區設施溫棚內開展田間防效試驗。葡萄品種為陽光玫瑰，選用室內毒力測定防效好的3種藥劑。按照“1.2.2”的方法分別將枯草芽胞桿菌、膠凍芽胞桿菌和淡紫擬青霉用營養液孵育活化，配置成孢子濃度為1.0×108cfu/mL的藥液，以500 mL/667m2的阿維菌素(有效濃度為16.7 mg/L)和1 500 mL/667m2的噻唑膦(有效濃度為50 mg/L)作為陽性對照，施加等量清水為陰性對照，共設6個處理，每處理防治面積為10 m2(1 m×10 m)，處理間設置隔離保護行(兩行)，每處理重復3次。各藥劑共施用3次，施藥間隔期為7 d。采用灌根方式每次每小區施藥量為1 L。依據“1.2.1”中拔根百分法統計各處理間的病情指數。

參照劉玉霞等[13]的方法，每處理小區5點取樣，每點取20 cm深的根際土壤，土樣混合均勻后稱取100 g，采用貝爾曼式漏斗法分離土壤中的根結線蟲2齡幼蟲，在血球計數板上計數線蟲個數，統計在施藥前和施藥后各處理100 g土壤中線蟲的數量，計算土壤線蟲減退率，按土壤中線蟲減退率計算防治效果。

線蟲減退率=(處理前空白對照2齡幼蟲數量-處理后小區2齡幼蟲數量)/處理前空白對照2齡幼蟲數量×100%

防治效果=(處理區2齡幼蟲的減退率-對照區2齡幼蟲減退率)/(1-對照區2齡幼蟲減退率)×100%

1.2.4 數據處理 采用DPS軟件，以專業統計-生物測定-數量型數據機值分析計算各藥劑毒力回歸方程斜率、相關系數和致死中濃度，用鄧肯氏新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄苗圃根結線蟲病癥狀

葡萄苗圃內根結線蟲為害癥狀表現為地上部生長勢弱、植株矮小，葉片黃化、易脫落，葉緣卷曲(圖1-A)。根系(地下部)的主根和側根均形成大小不一的根結，有的根結連接成塊，形成褐色的根結瘤，最終根結連同病根腐爛壞亡，有的根結在根段上密集散布，形成念珠狀結構。根系受害嚴重時通常表現出結瘤、短粗、叢生、壞死等癥狀，致使根系吸收肥水能力減弱，影響葡萄苗的生長(圖1-B)。在體視顯微鏡下將根結表皮輕輕撥開，剖面上出現的白色梨形球狀物為根結線蟲雌蟲，蟲體主要寄生在根系的韌皮部(圖1-C)。

2.2 葡萄苗圃根結線蟲發病情況調查

寧夏玉泉營鎮葡萄苗圃15個品種中，除‘抗砧3號’外，其余14個葡萄品種均感染根結線蟲病，且不同葡萄品種受根結線蟲為害的嚴重度有明顯差異，其中‘西拉’感染根結線蟲病最嚴重，病情指數高達78.33；其次是‘紅芭拉蒂’，病情指數為70.00；‘大青’感染根結線蟲病較輕，病情指數為21.67(表1)。

表1 寧夏玉泉營鎮葡萄苗圃根結線蟲病調查

2.3 葡萄根結線蟲室內毒力測定

2.3.1 8種微生物源藥劑對南方根結線蟲2齡幼蟲的毒殺效果 8種微生物源藥劑在有效濃度為1.0×108cfu/mL觸殺處理96 h(4 d)，淡紫擬青霉對2齡幼蟲的累積校正死亡率最高，達 99.17%，與阿維菌素和噻唑膦致死效果相當；其次是膠凍芽胞桿菌，累積校正死亡率為85.00%；1.0×108cfu/mL枯草芽胞桿菌累積校正死亡率為52.50%，致死效果較好；其余藥劑的累積校正死亡率均在50%以下，致死效果較差(表2)。

表2 8種微生物源藥劑對南方根結線蟲2齡幼蟲的致死率

毒力測定結果表明，在處理96 h(4 d)后，淡紫擬青霉、膠凍芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌對南方根結線蟲2齡幼蟲的LC50值分別為3.56×106、3.69×106和8.58×107cfu/mL，毒力效果為淡紫擬青霉>膠凍芽胞桿菌>枯草芽胞桿菌。總體來看，淡紫擬青霉對南方根結線蟲2齡幼蟲的毒殺效果最強，膠凍芽胞桿菌次之，枯草芽胞桿菌則相對較弱(表3)。

表3 淡紫擬青霉、膠凍芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌對南方根結線蟲2齡幼蟲毒力測定相關參數

2.3.2 藥劑在不同孢子濃度和處理時間下對南方根結線蟲2齡幼蟲致死效果 淡紫擬青霉(圖2-A)、膠凍芽胞桿菌(圖2-B)和枯草芽胞桿菌(圖2-C)對南方根結線蟲2齡幼蟲的校正死亡率均隨著孢子濃度和處理時間的增加而增高，且這3種藥劑對2齡幼蟲的致死效果不同。當藥劑處理60 h時，使校正死亡率達到50%，淡紫擬青霉、膠凍芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌所需要的孢子濃度依次為6.25×106cfu/mL、1.25×107cfu/mL和 1.0×108cfu/mL。此外，當3種藥劑孢子濃度為 1.0×108cfu/mL時，使校正死亡率均達到50%，淡紫擬青霉、膠凍芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌所需要的處理時間依次為24 h、36 h和60 h。表明淡紫擬青霉在較短的處理時間和較低的孢子濃度下，仍然會對2齡幼蟲具有較好的致死效果。由此可知，淡紫擬青霉對南方根結線蟲2齡幼蟲的致死效果最好，膠凍芽胞桿菌次之，枯草芽胞桿菌相對較差。

2.3.3 不同藥劑處理后南方根結線蟲2齡幼蟲致死癥狀 南方根結線蟲2齡幼蟲經枯草芽胞桿菌、膠凍芽胞桿菌、淡紫擬青霉和阿維菌素4種藥劑處理后，蟲體呈現“J”型死狀，體前端出現小泡狀的組織崩解(圖3-A～3-D)，其中枯草芽胞桿菌處理后，整個蟲體透明，蟲體內容物變淺未發生聚集(圖3-A)；膠凍芽胞桿菌處理后，蟲體前端出現密集的點狀小泡，組織崩解程度高(圖3-B)；淡紫擬青霉處理后，體前端崩解程度低，蟲體中部出現部分內容物聚集(圖3-C)；阿維菌素處理后，體前端崩解程度高，且蟲體中后端內容物大量聚集(圖3-D)。噻唑膦處理后，整個蟲體破裂，皺縮(圖3-E)。

2.4 葡萄苗圃根結線蟲的防效試驗

淡紫擬青霉、膠凍芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌對葡萄苗圃內根結線蟲病均有一定的防治效果，其中淡紫擬青霉的防效最好，根際土壤線蟲減退率最高，為85.43%，防治效果可達83.11%；其次是膠凍芽胞桿菌，根際土壤的線蟲減退率和防效分別為79.53%和76.26%，淡紫擬青霉和膠凍芽胞桿菌的防效均高于化學藥劑噻唑膦；枯草芽胞桿菌的防效較差，應用價值低(表4)。

表4 3種微生物源藥劑對葡萄苗圃根結線蟲的防治效果

3 討 論

根結線蟲作為一類分布廣、危害性大且難以防治的植物寄生線蟲，已成為制約葡萄產業發展的重要病害。本研究調查發現，在葡萄苗圃內根結線蟲病害發生較重，生產上廣泛應用的釀酒葡萄品種‘西拉’的病情指數高達78.33。葡萄苗木受根結線蟲的為害后，地上部表現出生長衰弱、植株矮小、葉片黃化，根系形成念珠狀根結，這與劉勇等[14]發現的葡萄根結線蟲病害癥狀一致。葡萄苗圃中高復種指數造成根結線蟲的蟲卵累積，導致根結線蟲病害迅速傳播蔓延，在生產上應當引起高度重視。

微生物源藥劑具有環境污染小、對人畜安全、不易產生抗藥性等優點，已逐漸替代化學藥劑，成為線蟲病害綠色防控的主要手段[15]。本研究通過室內毒力測定和苗圃防效試驗測定了8種生物藥劑對葡萄根結線蟲病的防效，發現淡紫擬青霉(P.lilacinum)對根結線蟲2齡幼蟲具有良好的毒殺和防治效果(校正死亡率為99.17%和防治效果為83.11%)，能破壞根結線蟲2齡幼蟲內部組織，使其死亡。這與王曦茁等[16]和Sarven等[17]的研究結果一致。

膠凍芽胞桿菌(B.mucilaginosus)是一種硅酸鹽細菌，具有分解鋁硅鹽類原生質態礦物的能力，常被用作果蔬和農作物種植的微生物菌肥[18]。研究發現膠凍芽胞桿菌(B.mucilaginosus)具有病害防治的潛質，在棉花炭疽病、茄子和香蕉枯萎病等病害防治已有良好的應用前景[19-20]。但目前國內尚未有關于膠凍芽胞桿菌(B.mucilaginosus)防治線蟲病害的研究報道，本研究首次發現膠凍芽胞桿菌(B.mucilaginosus)具有殺線活性(校正死亡率為85.00%和防治效果為76.26%)，這對今后微生物源殺線制劑的開發及應用提供理論依據。

微生物源藥劑作為一種安全有效手段在植物根結線蟲防治中得到了廣泛的研究和應用[21]。本研究成功篩選出淡紫擬青霉(P.lilacinum)和膠凍芽胞桿菌(B.mucilaginosus)兩種微生物源藥劑能有效防治葡萄根結線蟲病，可作為葡萄苗圃內根結線蟲病害防治的首選藥劑進行推廣應用。