哈茨木霉M-17固體發酵及發酵產物浸提液對鐮刀菌的抑制作用

譚嬌嬌，王喜剛，郭成瑾，張麗榮，沈瑞清,

(1.寧夏大學 農學院，銀川 750021；2.寧夏農林科學院 植物保護研究所，銀川 750002)

近年來，中國馬鈴薯種植面積不斷擴大，加之長期連作，使得因鐮刀菌(Fusariumspp.)引起馬鈴薯土傳病害日益加劇，造成了嚴重經濟損失[1]。這類土傳病害的病原菌生活史大都發生在土壤中，從根部和莖部開始侵染[2]，在早期發病時地表上部癥狀不明顯，不易被發現。該類病原菌傳染性極強，具有較大的爆發性和毀滅性，極難防治[3]。

過去人們常使用化學農藥來防治這類病害，極易造成農藥殘留和環境污染等問題。開發利用對非靶標生物安全、有益于環境友好的生物農藥迫在眉睫。生物防治具有無污染、無公害、效益長等優點，展現出其廣闊的發展前景和應用市場[4]。經研究發現，利用木霉菌等微生物資源來防治植物病蟲害，既能有效抑制土傳病害發生，還具有提高營養利用效率、促進植物生長、增強植物抗逆性和修復農化污染環境等功能[5-6]。

木霉(Trichoderma)是廣泛存在于植物根部、土壤、海洋及植株殘體中的一類真菌[7-8]，具有生命力強，適應性廣等特點。據報道木霉屬真菌約有250余種[9]。木霉菌在農業上應用廣泛，對農作物、中草藥和園林植物病害的防治都有較好的效果[10-11]。作為生防制劑在農林業使用廣泛的木霉菌有哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、深綠木霉(T.atroviride)和綠色木霉(T.viride)[12]。木霉菌不僅能夠在大多數植物根系中定殖和生長，還可以促進根的生長增加作物產量[13-15]。木霉的固體發酵是木霉通過利用工業或農業副產品廢棄物作為培養基在一定發酵條件下生長并產生代謝產物的過程。常用的固體發酵原料有麥麩、米糠、甘蔗渣、麥粒、花生粉餅、秸稈等。有研究表明中藥渣中含有微生物生長所需的營養物質[16]，纖維孔隙率高，易于菌絲的生長和繁殖。因此中藥渣常用來作為食用和藥用菌的培養基質[17]。本試驗選擇哈茨木霉M-17作為供試菌株，以中藥藥渣粉作為主要的培養基成分進行固體發酵，并將其發酵產物用于抗菌試驗研究，以便為該菌的深入研發提供有益的試驗數據并對木霉菌商品化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 哈茨木霉M-17、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、接骨木鐮刀菌(F.sam-bucinum)、木賊鐮刀菌(F.equiseti)、茄病鐮刀菌(F.solani)和銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)均由寧夏農林科學院植物保護研究所提供。

1.1.2 固體發酵培養基 玉米粉、葡萄酒皮渣、木屑、中藥渣固體培養基：甘草、板藍根。以上材料均購自銀川農用材料市場。

1.2 方 法

1.2.1 菌株M-17與病原菌的對峙試驗 將菌株M-17與病原菌分別轉接于PDA固體平板，于25 ℃黑暗條件下培養5 d后，分別用打孔器(Φ=10 mm)沿菌落邊緣打1塊菌餅，放入PDA固體培養基中線上(一個生防菌菌餅對應一個病原菌菌餅)，兩菌餅之間的距離須大于20 mm，共設置2個重復，空白對照不接入菌株M-17，于25 ℃黑暗條件下靜止培養約7 d，測量菌落半徑。考察M-17與病原菌的拮抗性。

1.2.2 菌株M-17的發酵 將甘草和板藍根以及甘草+板藍根+葡萄酒皮渣分別與玉米粉、木屑以總質量40 g為標準按比例配制培養基，甘草+玉米粉+木屑、板藍根+玉米粉+木屑和中藥渣+玉米粉+木屑均按比例5∶4∶1、7∶2∶1和3∶5∶2配制3個比例，甘草+板藍根+葡萄酒皮渣+玉米粉+木屑按比例2∶0∶6∶4∶1、0∶2∶6∶4∶1和2∶2∶4∶4∶1分別加入250 mL三角瓶中，130 ℃高壓滅菌60 min。分別接入菌株M-17的種子液或菌餅，于25 ℃下靜置培養3 d，手工搖瓶(增加與養料的接觸)后繼續靜置培養9～12 d，待菌絲長滿培養基后取出，備用。

1.2.3 菌株M-17的發酵產物對病原菌的抑制效果 取1 g發酵物，烘干后粉碎，加入2 mL無菌水充分振。12 000 r/min離心10 min，將上清液過6 μm濾膜。取500 μL濾液滴于PDA培養基中，用無菌涂布棒涂布均勻，備用。用“1.2.1”的方法取病原菌菌餅，放入涂布發酵產物的PDA平板中，于25 ℃黑暗條件下靜置培養。共設置9個重復，空白對照不涂抹發酵產物，9 d后測量菌落半徑。觀察發酵產物對馬鈴薯根腐鐮刀菌(木賊、接骨木、尖孢、茄病、銳頂)的抑制效果。

1.3 菌落抑制率計算

以直尺取菌落互相垂直的兩個直徑分別讀數，并以PDA固體培養基接入一塊病原菌菌餅為對照，菌落抑制率=(SCK-S1)/SCK×100%，其中SCK表示對照半徑距離(cm)，S1表示在PDA固體培養基上涂布生防菌發酵產物后接入病原菌菌落的處理半徑距離(cm)。

1.4 數據統計分析

采用Excel 2010對試驗結果進行統計分析，用SPSS 26.0.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株M-17與病原菌的對峙試驗

由表1可知，生防菌M-17對對茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和接骨木鐮刀菌抑制效果較好，抑制率分別為66.38%、66.39%和66.18%(圖1-a、圖1-b、圖1-c)；對銳頂鐮刀菌和木賊鐮刀菌的抑制效果最差，其中對木賊鐮刀菌的抑制率為 57.06%(圖1-e)，對銳頂鐮刀菌的抑制率最低為 51.29%(圖1-d)。

表1 菌株M-17對5種鐮刀菌的生長影響以及抑制作用

2.2 發酵固體培養基的篩選

根據菌株M-17在含有甘草或板藍根或葡萄酒皮渣的固體培養基的生長情況，挑選菌絲長滿培養基，并且可見大量菌絲，干燥后顏色為褐色或淡褐色的培養基，篩選出1-1、1-2、1-3、2-3和4-1五種含有中藥的固態培養基類型。由表2可知，甘草和板藍根都具有促進生防菌M-17菌絲生長的能力。在相同配比情況下，板藍根的促進效果更好，8 d菌絲就已布滿培養基。但在有葡萄酒皮渣參與發酵的情況下，甘草的促進效果要好于板藍根。

表2 菌株M-17的固態發酵效果

2.3 菌株M-17中藥渣固態發酵產物的抑菌效果

不同配方接種菌株M-17發酵后，發酵產物的抑制效果隨著時間的增加而提高，在第7天時抑制率普遍高于第5天和第3天。不同配方發酵下的發酵產物對每種鐮刀菌的抑制效果差異顯著(表3)。

表3 菌株M-17中藥固態發酵產物對不同鐮刀菌的抑制效果

2.3.1 對茄病鐮刀菌的抑制效果 用配方1-1發酵M-17菌株7 d后，發酵產物對茄病鐮刀菌抑制效果最好，抑制率為75.65%；其次是配方1-2，抑制率為73.65%；配方2-3、配方1-3和配方 4-1，抑制率分別為72.14%、70.60%和70.07%。因此配方1-1在25 ℃時發酵M-17菌株7 d對茄病鐮刀菌的抑制效果最好。

2.3.2 對尖孢鐮刀菌的抑菌效果 使用不同配方的發酵產物對尖孢鐮刀菌的抑制效果顯著，配方2-3發酵菌株M-17的發酵產物對尖孢鐮刀菌的抑制率最高，為76.78%，其次為配方4-1，抑制率為75.92%，配方1-2、配方1-3和配方1-1，抑制率分別為72.91%、72.20%和69.31%。因此配方2-3在25 ℃發酵M-17菌株7 d時對尖孢鐮刀菌的抑制效果最好。

2.3.3 對接骨木鐮刀菌的抑菌效果 利用配方 1-3和配方4-1發酵菌株M-17，發酵7 d后的發酵產物對接骨木鐮刀菌的抑制效果無顯著差異，抑制效果都較好，抑制率分別為67.61%和 67.20%。其次是配方1-1，抑制率為67.05%，配方1-2和配方2-3，抑制率分別為65.32%和 61.31%。綜上，配方1-3在25 ℃發酵M-17菌株7 d時對接骨木鐮刀菌的抑制效果最好。

2.3.4 對銳頂鐮刀菌的抑菌效果 配方1-2和配方1-1發酵菌株M-17的發酵產物對銳頂鐮刀菌的抑制效果無顯著差異，但較其他3種配方，抑制效果差異顯著，抑制率分別為68.72%和 67.66%。其次是配方1-3、4-1和2-3，抑制率分別為67.57%、63.08%和61.80%。綜上，配方 1-2在25 ℃發酵M-17菌株7 d時對木賊鐮刀菌的抑制效果最好。

2.3.5 對木賊鐮刀菌的抑菌效果 配方1-3、2-3和配方4-1固態發酵菌株M-17，發酵7 d后，發酵產物對木賊鐮刀菌的抑制效果沒有顯著性差異，抑制率分別為78.45%、77.99%和77.86%，配方1-3與配方1-2和配方1-1有顯著性差異，抑制率分別為77.19%和76.89%。綜上，配方1-3在 25 ℃發酵M-17菌株7 d時對木賊鐮刀菌的抑制效果最好。

3 討 論

研究表明木霉對馬鈴薯的土傳病害有良好的防治作用。Wharton等[18]利用哈茨木霉防治馬鈴薯晚疫病，使得晚疫病發病率降低30%～45%。Kahkashan等[19]分離的哈茨木霉TvDPs、TDPs和T1s3種菌株對尖孢鐮刀菌的抑制率分別為66.3%、57.4%和56.4%。潘瀟涵等[20]研究表明哈茨木霉VT9-3r對尖孢鐮刀菌、茄鏈格孢的抑制率分別為64.0%和60.2%。本試驗利用哈茨木霉M-17與病原菌尖孢鐮刀菌、接骨木鐮刀菌、木賊鐮刀菌、茄病鐮刀菌和銳頂鐮刀菌分別進行對峙試驗，研究發現哈茨木霉M-17對尖孢鐮刀菌的抑制率最高，為66.39%；對銳頂鐮刀菌的抑制率最低，為51.29%。因木霉菌的作用機制多樣，同一種木霉對不同病原菌的作用機制也存在差異[11]，故對不同病原菌的抑制效果也 不同。

木霉菌的固體發酵大多使用工業或農業廢棄物作為發酵培養基質。陳燕萍等[21]以微生物發酵床養豬墊料發酵地衣芽孢桿菌，曾才慶等[22]用哈茨木霉FJAT-9040發酵。常用的固體發酵原料有麥麩、米糠、甘蔗渣、麥粒、花生粉餅、秸稈等。近年來中藥渣也漸漸應用到微生物的發酵中。楊麗紅等[23]利用中藥渣發酵亮菌進行研究，結果表明供試的中藥渣固體發酵培養基發酵亮菌均可產漆酶，且在優化培養條件后漆酶的酶活提高了19倍。本次試驗利用甘草、板藍根、葡萄酒皮渣和中藥渣(30%甘草藥渣粉、10%板藍根藥渣粉和60%葡萄酒皮渣)與玉米粉和木屑按照不同的比例配制成不同固體培養基。通過觀察木霉菌的發酵效果發現，發酵8～9 d時菌絲基本長滿，部分有結團現象。其中發酵效果明顯的配方有：甘草、玉米粉和木屑配比為5∶4∶1、7∶2∶1和3∶5∶2；板藍根、玉米粉和木屑配比為3∶5∶2；甘草、板藍根、葡萄酒皮渣、玉米粉和木屑配比為2∶0∶6∶4∶1。對比不同發酵培養基的發酵結果發現，甘草和板藍根在菌株M-17發酵過程中促進菌絲生長效果明顯。將這幾種配方發酵M-17的發酵產物分別用于病原菌的抗性試驗，結果表明不同配方接種M-17發酵后，發酵產物對病原菌的抑制率在第7天時均較高，但每種配方對不同病原菌的抑制率有差異。這幾種配方發酵M-17的發酵產物對尖孢鐮刀、茄病鐮刀菌和木賊和鐮刀的抑菌率達70%以上，其中對木賊鐮刀菌的抑制率最高，達到了78.45%。

經試驗觀察發現，木霉發酵時不同固體培養基基質所需的水分、pH以及不同菌種的培養溫度等條件均會影響菌株生長和代謝產物的產生[21]。本次試驗還未對發酵條件進行全面的優化，但結果顯示中藥渣發酵哈茨木霉M-17的發酵產物對部分馬鈴薯土傳病害病原菌的抑制效果良好。優化固體發酵條件之后預估會提高發酵產物的質量，增加對病原菌的抑制率。