巨大芽孢桿菌對商洛烤煙生長及土壤微生物的影響

陳月星，黃金輝，劉翠霞，閆超超，張永鋒，李立丹

(1.商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西商洛 726000；2.陜西秦嶺特色生物資源產業技術研究院，陜西商洛 726000；3.商洛市煙草公司洛南分公司，陜西商洛 726000；4.陜西省煙草公司 商洛市公司，陜西商洛 726000)

中國是一個煙草大國，煙草產業在中國國民經濟中占有重要的地位，煙葉和卷煙產量均居世界首位，煙草種植面積為13 300 km2，年產量為 450萬～500萬t[1]。煙草栽培過程中，由于長期連作和化肥的連年使用，導致植煙土壤結構變差[2-3]、肥料利用率降低、肥力下降、土壤微生物多樣性減少[4-5]、病蟲害加重等生產和生態問題，嚴重制約著煙葉質量風格的形成和可持續健康發展。而改良土壤、培肥地力，構建以“土壤-微生物-根系”為核心的高效健康的煙田微生態系統是解決這一問題的途徑之一。

前人研究結果表明，施用微生物菌劑可促進土壤養分吸收，提高煙葉品質[6-9]，降低煙草病蟲害發生率[10-11]，能夠改善土壤環境、實現土壤保育[12-15]，有利于煙區的健康和可持續發展，具有十分重要的生產、生態和經濟效益。基于此，本文通過田間試驗研究巨大芽孢桿菌菌劑對秦嶺商洛地區烤煙的生長及土壤微生物的影響，以期通過微生物菌劑的施用改善烤煙根際微生態環境，促進烤煙生長，提高煙葉產質量。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

商洛地處秦嶺腹地，位于亞熱帶向暖溫帶過渡地帶，氣候溫和，山青水秀，林豐礦富。該區域光照資源豐富，日照時數為2 133.8 h，春夏日照時數最多，年均氣溫12.9 ℃，7月間氣溫最高 25 ℃左右，≥10 ℃的積溫為4 142.7 ℃，年降雨量800～900 mm，多集中在6至9月份，占全年降水量的50%以上。試驗田位于陜西省商洛市洛南縣柏峪寺鎮薛樓村(34°10′2″N，110°20′5″E)，土壤基本理化性質為：pH 5.47，有機質8.60 g/kg，速效磷27.75 mg/kg，速效鉀 152.25 mg/kg。

1.2 供試材料

烤煙品種：‘云煙99’。

菌劑：巨大芽孢桿菌購于北京航天恒豐科技股份有限公司，活菌含量為1×109CFU/g。

1.3 試驗設置

按巨大芽孢桿菌施用量，試驗設置6個處理：對照CK(不施用菌劑)、A1(2 kg/667m2)、A2(6 kg/667m2)、A3(10 kg/667m2)、A4(14 kg/667m2)、A5(16 kg/667m2)，移栽時與定根水混溶施于煙株根部，每個處理重復3次，共18個小區，每個小區4行，每行包含15株烤煙，每個小區共計60株，小區面積3.6 m×8.4 m，試驗小區四周設置保護行(左右各2行，前后各3株煙)，各處理除微生物菌劑的施用外，其他操作與對照(CK)保持一致，均按本年度當地常規操作要求執行。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 煙株農藝性狀觀測 各處理分別選取有代表性的煙株10株，于打頂后測定煙株的株高、莖圍、節距、單株有效葉片數、腰葉長和寬。

1.4.2 主要經濟性狀分析 各處理單獨采烤，進行烤后煙葉外觀質量鑒定，根據烤煙42級國家標準對烤后煙葉進行分級，統計各處理煙葉的產量、產值、均價及上中等煙比例等經濟性狀。

1.4.3 土壤微生物群落特征分析 分別于移栽后30 d(團棵期)、移栽后60 d(旺長期)和移栽后90 d(成熟期)采集土樣，每個處理選取長勢一致的煙株3株，采用抖根法，收集抖落的根際土壤，混合后用無菌袋保存。

本研究應用土壤小量DNA提取試劑盒(OMEGA，USA)提取土壤微生物總DNA，采用瓊脂糖凝膠DNA回收和純化試劑盒(天根，北京)進行純化，應用高通量測序的方法(Illumina Miseq Platform)測定16S rDNA基因序列V3片段分析煙株根際土壤微生物群落特征。

1.4.4 數據分析 采用 Microsoft Excel 2003整理數據，應用SPSS 16.0軟件對煙草農藝性狀和經濟性狀進行方差分析，采用Duncan’s新復極差法進行多重比較(P<0.05)。

使用Qiime2軟件中的DADA2插件對原始序列(input)進行質量控制(filtered)，去噪，拼接，并且去嵌合體，形成操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTU)。對OTU進行豐度、多樣性指數等分析，對物種進行注釋并在門分類水平上進行群落結構的聚類分析和統計比較分析，分析各處理之間的微生物群落結構差異。

2 結果與分析

2.1 巨大芽孢桿菌對烤煙主要農藝性狀的影響

由表1可知，施用巨大芽孢桿菌各處理的煙株的株高、莖圍、節距、單株有效葉片數、腰葉長和寬均高于對照處理，其中A2處理各農藝性狀與對照間差異均達到顯著水平(P<0.05)，A1和A5與對照差異不顯著，A3和A4在莖圍上顯著高于對照，其他農藝性狀與對照無顯著差異。可見，施用巨大芽孢桿菌有助于烤煙的生長，其中A2處理效果最佳。

表1 烤煙主要農藝性狀方差分析

2.2 巨大芽孢桿菌對烤煙主要經濟性狀的影響

由表2可知，除667 m2產量外，菌劑各處理的667m2產值、均價和上等煙比例均顯著高于對照處理(P<0.05)，較對照分別提高0.4%～1.3%、3.4%～7.4%、2.1%～5.8%、2.8%～7.1%。其中A2處理各經濟性狀最佳，667m2產值、均價和上等煙比例顯著高于其他處理(P< 0.05)。由此可見，施用巨大芽孢桿菌可提高烤煙的經濟效益。

表2 烤煙主要經濟性狀方差分析

2.1 巨大芽孢桿菌對烤煙根際土壤微生物的 影響

2.2.1 巨大芽孢桿菌對土壤微生物群落組成的影響 圖1為施用巨大芽孢桿菌后不同時期(F-移栽后30 d、S-移栽后60 d、T-移栽后90 d)土壤微生物群落組成門分類水平的熱圖。由圖可知，移栽后30 d，土壤微生物主要優勢菌群有變形菌門、放線菌門和厚壁菌門，與對照相比，巨大芽孢桿菌處理的樣品中厚壁菌門比例顯著提高。移栽后60 d，土壤微生物群落優勢菌群主要有變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門、厚壁菌門和擬桿菌門(Bacteroidetes)。移栽后90 d，土壤微生物主要優勢菌群為放線菌門、變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和綠彎菌門。綜上可知，該區域土壤微生物主要優勢菌群為變形菌門和放線菌門，該優勢貫穿烤煙整個生育期，另有酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、擬桿菌門等在特定時期表現出一定的優勢，芽孢桿菌屬于厚壁菌門，該菌在施用后30 d表現為優勢菌群，隨著生育期的推進優勢逐漸減弱。

2.2.2 不同時期土壤微生物群落多樣性指數分析 圖2為移栽后60 d，芽孢桿菌各水平處理土壤微生物群落多樣性指數，由圖可知，不同施用水平處理 Chao1多樣性指數、faith_pd、Simpson指數以及OTU數量均極顯著顯著高于對照(P<0.01)。其中chao1指數A4最高，其次為A1，且A1、A2和A5顯著高于對照(P<0.05)。除了A3處理與對照差異不顯著外，其他各處理faith_pd指數和OTU數量均顯著高于對照。Simpson指數在A1處理中最高，其次為A2和A3，芽孢桿菌各水平處理均顯著高于對照(P<0.05)。

2.2.3 群落組成差異分析 圖3為不同處理之間β多樣性分析PLS-DA圖，由圖可知對照與其他施用菌劑的處理距離較遠，說明菌劑各水平處理與對照間差異較顯著，AUC曲線中所得比值為1，圖中所示施用菌劑各處理也存在明顯的差異，特別是移栽后30 d和90 d。移栽后60 d的分析結果中，A1與其他各處理差異顯著(P<0.05)，其余處理間差異不顯著。

3 討論與結論

本研究通過巨大芽孢桿菌不同施用量和對照進行對比分析，結果表明，施用巨大芽孢桿菌可有效促進烤煙生長，提高烤煙產量、產值、均價及上等中等煙比例，顯著增加烤煙經濟效益，該結論與王勇乾等[15]、徐宗昌等[16]研究結果基本一致。同時，菌劑的施用改變了烤煙根際土壤微生物群落特征，本研究結果表明，該區域土壤微生物優勢菌群主要為變形菌門和放線菌門，該菌群優勢在烤煙生長始末均一直保持，其他菌群在烤煙生長的不同時期表現出優勢或優勢減弱，本試驗采用的巨大芽孢桿菌為厚壁菌門，研究發現，在移栽后30 d時，該菌群優勢明顯，隨著生育期的推進，優勢逐漸減弱，可能是到6月后，該地區溫度上升，雨量增加，致使其他細菌類群繁殖旺盛，該菌群優勢相對減弱。微生物多樣性指數在移栽后60 d，即烤煙旺長期，各菌劑處理均顯著高于對照，且各處理間微生物群落結構差異顯著。

在農田生態系統中，土壤微生物具有不可忽視的作用，它們參與有機物的分解與合成、腐殖質的形成及養分循環等重要的生態過程[17-18]。微生物菌劑的施用改變原有土壤微生物群落組成、群落結構及種群多樣性，影響生態系統的物質循環、能量轉換和生態功能[19]，進而影響烤煙的生長。劉智炫等[13]研究表明，接種根際促生菌能降低煙田土壤容重和固相比，提高土壤總孔隙度，有利于烤煙生育后期土壤田間持水量的提高。王勇乾等[15]研究發現，解磷細菌肥配施磷肥可極顯著提高烤煙根際土壤有效磷含量和土壤微生物對碳水化合物、氨基酸以及胺類碳源的利用能力。黃正強等[20]研究表明，沖施微生物菌劑增添了土壤中有益微生物菌群，提高了化肥利用率，促進了煙草生長發育，其中施用菌劑處理增產6.1%，凈增值223.83元/667m2。

綜上所述，施用微生物菌劑在一定程度上可通過改善土壤理化條件，促進烤煙生長，提高其經濟效益，但是不同的菌劑種類、施用時間、施用方式、施用量以及不同煙區，其效果不盡相同，因此，微生物菌劑的施用應根據所在煙區存在的主要問題，因時因地制宜，才能取得較理想的效果。