尖孢鐮刀菌HG-11響應解淀粉芽胞桿菌B501脅迫的機制分析

馬 佳,胡 棟, 田 碩,2, 彭杰麗, 張翠綿, 賈 楠, 王占武

(1.河北省農林科學院 農業資源環境研究所(河北省肥料技術創新中心)，石家莊 050051;2.河北師范大學 生命科學學院，石家莊 050024)

在生物防治領域，研究重點多集中在生防菌對病原菌的抑菌機制，生防機制主要包括競爭、重寄生、拮抗、抗生和誘導抗性等方面[1]。但病原菌如何抵御有益生防菌的脅迫，如何影響生防效率的機理卻常被忽略。如同有益菌有多種機制拮抗病原菌，病原菌同樣具有多種反拮抗機制，應答生防菌的脅迫壓力。Chen等[2]建立了以“生防細菌-赤霉病菌”為模式的“細菌-真菌”跨界互作研究系統，首次發現生防細菌綠針假單胞菌(Pseudomonapiscium)ZJU60通過分泌抑菌物質吩嗪-1-甲酰胺抑制禾谷鐮刀菌的組蛋白乙酰化，進而抑制赤霉病的發生。病原菌對化學殺菌劑產生抗藥性已眾所周知，同樣病原菌是否也對拮抗菌的脅迫產生抗性，其抗性機制如何，需要深入探索。

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)屬芽胞桿菌屬，是生防菌研發的熱點[3]，具有抗菌譜廣、抗逆性強及生物安全性高等優點。解淀粉芽胞桿菌主要通過分泌次生代謝產物抑制病原菌的生長發育，其次生代謝產物的種類較多，具有抗菌特性的物質主要包括：脂肽類抗生素和抗菌蛋白[4]。脂肽類抗生素(Lipopeptide antibiotic)根據其結構可分為伊枯草菌素(Iturin)家族、表面活性素(Surfactin)和泛革素(Fengycin A、B)[5]。其中表面活性素與細菌生物膜的形成有關，芽胞桿菌能夠在植物根系以生物膜形式定殖，并分泌具有殺菌作用的表面活性素[6]。抗菌蛋白包括：抗菌肽、細胞壁降解酶等。芽胞桿菌菌體產生的細胞壁降解酶是一類重要的抗菌蛋白，主要包括幾丁質酶、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等以及其他豐富的代謝產物[7]，可抑制病原菌菌絲生長和孢子萌發。

由致病性尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起的植物枯萎病在全世界十大植物真菌病害中排在第5位[8]。植物枯萎病是一種土傳真菌病害，嚴重感病植株整株枯黃萎蔫，最終枯死，在作物的全生育期內均可發生，給農業生產造成巨大經濟損失[9]。由河北省農林科學院農業資源環境研究所農業微生物研究室分離得到的一株解淀粉芽胞桿菌B501，經測定對尖孢鐮刀菌HG-11具有較高的抑制效果。在其發酵液處理下，HG-11菌絲生長受到抑制，菌絲腫大變粗，這種形態改變可能是B501產生的抑菌物質對 HG-11作用的結果，而HG-11如何響應或應答B501抑菌物質的毒害并不清楚。

本研究首先檢測B501的生物膜、蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等生防相關因子，初步了解B501對HG-11的生防機理；然后以B501和HG-11作為生防微生物和植物病原微生物互作系統，采用轉錄組測序技術比較分析HG-11野生型菌株和經B501發酵液處理后菌株的基因表達特征，并結合B501所具有的生防因子以及可能的抑菌方式進行分析，從而在轉錄組水平上揭示HG-11對B501脅迫的響應機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽胞桿菌B501菌株由河北省農林科學院農業資源環境研究所農業微生物實驗室保存，尖孢鐮刀菌 HG-11由河北省農林科學院植物保護研究所提供。

1.1.2 主要試劑及培養基 MSgg(Minimal salts glycerol glautamate)培養基用于B501生物膜的培養，固體培養基培養菌落型生物膜，液體培養基培養薄皮型生物膜[10]；淀粉培養基用于檢測B501能否產生淀粉酶；1%脫脂牛奶瓊脂培養基用于檢測B501能否產生蛋白酶；纖維素酶篩選培養基用于檢測B501能否產生纖維素酶[11]。

HG-11固體培養采用PDA(Potato dextrose agar)培養基，液體培養采用PDB(Potato dextrose broth)培養液[12]；B501液體培養采用LB(Luria-Bertani)液體培養基[13]，30 ℃發酵培養 24 h，8 000 r/min離心5 min，經0.22 μm無菌過濾器過濾所得即為發酵液。

1.2 B501對尖孢鐮刀菌HG-11菌絲生長的抑制

在 PDA平板中間接種直徑 5 mm 的HG-11菌餅，距離菌餅中心2.5 cm 處對稱放置4 張直徑6 mm 的小濾紙片，每張紙片上滴加10 μL B501菌液，對照滴加10 μL無菌水，30 ℃培養，5 d后觀察分析菌落形態，每個處理重復 3 次。

1.3 B501生防相關因子的測定

1.3.1 生物膜的檢測 將活化24 h的B501單菌落接種到LB液體培養基里，30 ℃、180 r/min振蕩培養過夜，將過夜搖瓶培養的發酵液按 1∶1 000比例加入到含有MSgg培養基的12孔組織培養板中，在23 ℃下培養，3 d后觀察B501生物膜的形成情況。薄皮型生物膜和菌落型生物膜檢測各3個重復。

1.3.2 淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的檢測 參考李洪濤[11]的方法。

1.4 B501發酵液對HG-11菌絲形態及基因表達的影響

將1 mL 濃度為 1×107個/mL HG-11分生孢子接入100 mL PDB中，28 ℃、200 r/min 振蕩培養，3 d后加入5 mL B501發酵液，繼續振蕩培養48 h，菌絲置于400倍放大的光學顯微鏡下(ZEISS Primo Star, 德國)觀察，當菌絲腫大變粗變形后收集菌絲，用液氮速凍后放置-80 ℃超低溫冰箱中保存。B501發酵液處理的樣品標記為B501，對照處理只加入LB培養液，樣品標記為CK，兩組處理分別收集3份菌絲樣品。

1.5 HG-11菌絲轉錄組測序

采用Trizol試劑(Invitrogen, 美國)從處理樣品中提取total RNA，利用Nanodrop 2000對所提RNA的濃度和純度進行檢測。從總RNA中分離出mRNA，通過Oligo(dT)磁珠富集總RNA中帶有polyA結構的mRNA，mRNA經離子打斷的方式被打斷為長度300 bp左右的片段。以RNA為模板，用六堿基隨機引物和逆轉錄酶合成cDNA第1鏈，再以cDNA為模板進行第2鏈cDNA的合成。建庫試劑盒采用VAHTS mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina(諾唯贊NR611，中國)。通過Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫進行質檢，文庫大小450 bp，再對文庫總濃度及文庫有效濃度進行檢測。樣品經過RNA抽提、純化、建庫之后，采用第2代測序技術(Next-generation sequencing，NGS)，基于Illumina HiSeq測序平臺(Illumina nova seq 6000)，對這些文庫進行雙末端(Paired-end，PE)測序[14]。

1.6 差異基因表達分析

以FPKM(Fragments per kilobase million)表示基因的表達量。使用轉錄組表達定量軟件RSEM，以轉錄本序列為參考，通過測序深度和基因長度計算每個基因的FPKM值。B501處理組樣品和CK樣品間的差異表達基因(DEGs)通過DESeq進行分析，DEGs的篩選條件為：表達差異倍數|lbFoldChange|> 1，顯著性P值<0.05。

1.7 GO分類注釋和KEGG注釋富集分析

使用topGO進行Gene Ontology(GO)富集分析，應用超幾何分布方法計算P值，顯著富集的標準為P值<0.05，確定差異表達基因顯著性富集的GO功能分類。根據差異表達基因的Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)富集分析結果，篩選P值最小，即富集最顯著的途徑進行分析[15]，找出差異顯著性富集的生化代謝途徑和信號轉導途徑。

2 結果與分析

2.1 B501對HG-11菌絲生長的抑制

通過對峙培養的方法，發現B501對HG-11產生的抑菌圈清晰，明顯抑制HG-11菌落擴展(圖1)。通過400倍的顯微鏡觀察發現，經 B501發酵液處理12 h后的HG-11菌絲膨大，變粗，扭曲，不能進一步延伸生長，對菌絲的形態有很大的破壞作用。而在對照PDB液體培養基中生長4 d的HG-11菌絲形態正常(圖2)，這表明B501產生的抑菌活性物質造成HG-11菌絲形態的改變。

2.2 B501生防因子的檢測

空氣-液體交界面薄皮型生物膜培養法是實驗室常用的體外模擬生物膜形成的方法之一，該法主要用以芽胞桿菌(Bacillusspp.)生物膜的研究；生物膜菌落培養法在固體平板表面形成的菌落形態和立體結構，也被認為與細菌的生物膜形成能力密切相關，這兩種方法常用于實驗室模擬天然生物膜簡單模型的建立[16]。檢測發現B501在MSgg固體培養基上形成粗糙細致的菌落形態，也能在MSgg培養液的空氣-液體交界面形成致密、厚實的脈絡式薄皮狀生物膜。培養基表面形成復雜的菌落結構作為評價菌株生物膜形成能力的標準之一，前期有研究表明芽孢桿菌生物膜形成能力與防病效果呈正相關，因此B501具備一定的生防能力。在纖維素酶和淀粉酶檢測中，菌落周圍都出現清晰的透明圈且透明圈直徑較大，說明B501能產生纖維素酶和淀粉酶，對纖維素和淀粉的分解能力較強；而蛋白酶的透明圈不明顯，則說明B501對蛋白質的分解能力較弱或可能不產生蛋白酶(圖3)。

2.3 HG-11受B501脅迫的基因表達特征

為了揭示HG-11受到 B501脅迫后基因表達特征的變化，收集B501發酵液處理48 h 的HG-11菌絲樣品(B501)和相同培養條件的未處理的HG-11菌絲對照樣品(CK)，分別提取總RNA，反轉錄成cDNA，構建文庫后進行轉錄組測序。經RSEM軟件計算基因的表達水平后，各樣品中基因表達量如圖4。通過比較兩組處理HG-11菌絲樣品的轉錄組FPKM密度分布圖發現，B501處理組樣品和CK樣品的基因總體表達量在離散度和總體分布度上存在一定差異(圖4)，表明HG-11在拮抗菌的脅迫處理下，部分基因的表達發生改變。

CK樣品共檢測到13 423個基因表達，而 B501處理組樣品共計13 118個基因表達，其中兩個樣品間共同表達的基因為11 461個。CK樣品特異表達的基因為1 961個，B501處理組樣品特異表達的基因為1 656個。使用DESeq2對樣品間差異表達基因進行檢測，按照差異顯著性標準進行篩選，統計基因顯著性差異表達上、下調情況。相比CK樣品，B501處理組樣品中3 171個基因差異表達顯著，其中2 106個基因上調表達，1 065個基因下調表達(圖5)，顯著上調差異表達基因多于顯著下調差異表達基因。

將差異基因按照其功能進行GO功能注釋，包括細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物學過程(biological process)3 個基本分類。在此基礎上將每一類進行細分，又可以分為30個小類，其中在細胞組分類別中涉及基因最多的為細胞膜組分，分子功能類別中涉及基因最多的為跨膜轉運活性和核糖體的結構組成，生物學過程類別中涉及基因最多的為跨膜轉運和線粒體翻譯。在上調表達基因中，參與膜構成、P-P-鍵-水解驅動的跨膜轉運蛋白、甾醇3-β-葡萄糖基轉移酶、氧化還原酶、核糖體蛋白復合物、異檸檬酸脫氫酶、蛋白質代謝等的基因表達較顯著。解淀粉芽孢桿菌能產生重要的酶系，包括降解多糖的酶類，如α-淀粉酶、纖維素酶、β-1，3-1，4-葡聚糖酶、木質纖維素降解酶、褐藻膠裂解酶和殼聚糖酶；也包括分解蛋白的酶類，如蛋白酶、溶栓酶和凝乳酶[7]。這意味著HG-11可能通過增加細胞膜合成途徑相關酶類基因的表達，以應對B501脅迫。下調表達基因主要參與酰基轉移酶、DNA連接酶、硫胺素代謝、催化酶、萜類生物合成等過程(圖6)。

2.4 轉錄組差異表達基因比較分析

2.4.1 HG-11細胞壁合成相關基因 芽胞桿菌產生纖維素酶，能夠作用于真菌細胞壁，抑制細胞壁合成，降解細胞壁纖維素成分，造成細胞壁強度減弱，細胞在內含物滲透壓作用下扭曲變形[17]。本研究中B501處理組樣品的菌絲腫大變粗，表明HG-11菌絲細胞壁受到破壞，可能與B501產生的纖維素酶有關。B501處理組樣品中的上調表達基因TRINITY_DN67_c0_g1(P=3.15×10-4)，注釋為脂糖基化，甾醇3-β-葡萄糖基轉移酶，UDP糖基轉移酶，與葡聚糖合成相關(表1)。該基因參與有機羥基化合物代謝過程，真菌細胞壁半纖維素木聚糖的生物合成[18]，因此推測該基因可能參與菌絲細胞壁的合成。上述結果表明，HG-11可能通過上調葡聚糖合成途徑的基因，提高葡聚糖或細胞壁的穩定性，應對B501纖維素酶的脅迫。

2.4.2 HG-11細胞膜合成和穩定性相關基因 已知解淀粉芽胞桿菌的抗菌物質一般作用于真菌細胞壁、細胞膜，通過破壞細胞壁及細胞膜的結構抑制真菌生長[19]，因此，HG-11細胞膜結構相關基因也是差異基因分析的重點。在B501處理組樣品中，TRINITY_DN17937_c0_g1基因上調表達(P=3.88×10-4)，該基因參與細胞內固醇轉運，同時與膜轉運相關的TRINITY_DN3230_c0_g1基因上調表達(P=2.03×10-9)，麥角固醇是真菌細胞膜重要組成成分，說明可能是HG-11通過促進麥角固醇生物合成以及調整細胞膜的流動性，來抵抗芽胞桿菌環脂肽類抗菌物質的傷害作用。TRINITY_DN19134_c1_g2基因表達上調(P=1.28×10-3)，該基因注釋為膜靶向共翻譯蛋白，參與HG-11細胞膜的合成(表1)，說明HG-11通過促進與細胞膜相關的蛋白表達，來抵抗芽胞桿菌抗菌物質的傷害作用。

脂肪酸是細胞膜磷脂的重要組成成分，影響細胞膜的穩定性。B501處理組樣品中直接參與脂肪酸合成的2個相關基因TRINITY_DN13494_c0_g1(P=0.036)和TRINITY_DN18207_c0_g4(P=0.036)，前者注釋為脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase)，后者注釋為脂酰輔酶A，參與脂肪酸的活化。脂肪酸生物合成過程的4個相關基因TRINITY_DN10179_c0_g1(P=0.011)、TRINITY_DN13494_c0_g1(P= 0.036)、TRINITY_DN18061_c0_g3(P=0.048)和TRINITY_DN9445_c0_g1(P=0.002)表達量顯著升高。TRINITY_DN18061_c0_g3編碼脂肪酸合成酶β亞基，TRINITY_DN13494_c0_g1基因編碼酰基輔酶A氧化酶，是脂肪酸β-氧化中的關鍵酶。TRINITY_DN10179_c0_g1和TRINITY_DN 9445_c0_g1參與細胞內脂質的合成和代謝過程(表1)。這6個基因在發酵液處理的HG-11上調表達可能也是協同緩解芽胞桿菌環脂肽類抗菌物質對細胞膜的傷害。此外，KEGG 注釋的差異表達基因中參與的脂質代謝途徑較為顯著(rich_factor 為0.33；Q 值為0.006)(圖7)。這反映出脂肪酸可能在HG-11抵抗芽胞桿菌環脂肽類抗菌物質傷害中起著重要作用。

2.4.3 HG-11細胞器合成和穩定性相關基因 核糖體和線粒體是細胞中兩個重要的細胞器，核糖體的主要功能是將遺傳密碼轉換成氨基酸序列并從氨基酸單體構建蛋白質聚合物[20]。線粒體通過三羧酸循環與氧化磷酸化進行能量轉化，產生ATP，供給細胞能量。KEGG 注釋的差異表達基因中參與的核糖體功能途徑最為顯著(rich_factor 為0.28；Q 值為0.0007)(圖7)。B501處理組樣品上調表達基因TRINITY_DN19037_c0_g2(P=1.20×10-12)編碼酰胺生物合成，對細胞內核糖核蛋白復合物的合成有重要作用。該基因上調說明HG-11通過促進與核糖體相關的蛋白表達，來抵抗芽胞桿菌抗菌物質的傷害作用。B501處理組樣品上調表達基因TRINITY_DN11875_c0_g1(P=0.017)注釋為線粒體基因，參與線粒體的合成，TRINITY_DN18930_c1_g1(P=1.48×10-7)基因編碼異檸檬酸脫氫酶，在三羧酸循環中將異檸檬酸轉化為α-酮戊二酸，對細胞的能量代謝、生物合成以及抗氧化脅迫起重要作用。TRINITY_DN16521_c0_g1(P=0.015)基因編碼細胞色素C氧化酶，細胞色素C氧化酶是線粒體呼吸鏈的終端酶，在機體內氧化代謝和ATP合成中起重要作用。TRINITY_DN18728_c0_g5(P=1.30×10-2)基因編碼鈣離子結合蛋白，參與線粒體儲存鈣離子途徑，從而控制細胞中的鈣離子濃度的動態平衡。另外，B501處理組樣品中顯著上調表達的ABC轉運器相關基因包括TRINITY_DN18474_c0_g2(P=2.13×10-5)和TRINITY_DN18721_c1_g12(P=0.024)，TRINITY_DN18474_c0_g2編碼P-P-鍵-水解驅動的跨膜轉運蛋白，TRINITY_DN18721_c1_g12基因編碼離子結合蛋白。ABC 轉運器蛋白具有外排泵功能，能與線粒體協作，將ATP水解產生的能量與結合的底物轉出質膜[21]，這5個與線粒體和ABC轉運蛋白相關的基因上調說明HG-11通過提高能量代謝，促進生物合成，來抵抗B501抗菌物質的傷害(表1)。

2.4.4 HG-11抗氧化脅迫類基因 解淀粉芽胞桿菌能夠產生抑菌物質對真菌細胞產生氧化性傷害，導致真菌細胞死亡[22]，而抗氧化作用的酶類則是關注的重點。KEGG 注釋的差異表達基因中參與的抗壞血酸和醛酸代謝途徑較為顯著(rich_factor 為0.41；Q 值為0.006)(圖7)。抗氧化酶類相關的上調表達基因有3個，其中TRINITY_DN11958_c0_g1(P=8.39×10-3)基因編碼過氧化物酶(Peroxidase，POD)，TRINITY_DN21685_c0_g1(P=0.024)基因編碼谷胱甘肽過氧化物酶，TRINITY_DN19192_c2_g2(P=1.07×10-6)基因編碼抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)。這3個基因可能參與HG-11抗氧化作用，它們的上調表達是HG-11消除自由氧脅迫作用的方式。此外，谷胱甘肽(glutathione, GSH)結合反應在維持細胞氧化-平衡狀態、外源物質解毒及抗氧化損傷中起著舉足輕重的作用[23]。B501處理組樣品中TRINITY_DN11990_c0_g2(P=2.26×10-6)編碼S-(羥甲基)谷胱甘肽合酶，TRINITY_DN21685_c0_g1(P=0.024)編碼谷胱甘肽轉移酶(Glutathione S-transferase，GSTs)，兩基因顯著上調表達(表1)。這些與GSH相關的酶類具有抗氧化和解毒作用，HG-11通過上調表達這些基因，消除活性氧和解毒，減輕B501的抗菌物質對HG-11菌絲細胞產生氧脅迫傷害。另外，ABC轉運器蛋白主要參與細胞內外物質的轉運，其外排泵功能能夠將有毒物質排出細胞外，進一步減輕B501的抗菌物質對HG-11菌絲細胞產生氧脅迫傷害。

2.4.5 HG-11細胞凋亡相關基因 已報道的解淀粉芽胞桿菌的表面活性素具有殺菌的作用，表面活性素與細菌生物膜的形成有關[24]，B501能夠產生生物膜，一般認為芽孢桿菌在MSgg中可以分泌更多能誘導生物膜形成的表面活性素，表面活性素具有強烈的抑制細菌和真菌的效果，不過產生更多表面活性素的具體機理還不清楚[25]。生物膜細菌對抗生素有很強抗性，具有較強的殺菌能力。HG-11轉錄組中12個基因與細胞凋亡有關，主要編碼細胞凋亡氧化修飾蛋白、細胞凋亡氧化應激蛋白、活性氧因子誘導凋亡等。除TRINITY_DN22470_c0_g1外，其他基因都與細胞凋亡相關，在B501處理組樣品中均上調表達。KEGG通路中與細胞復制有關的代謝途徑中的4個差異表達基因全部為下調基因(圖7)，其中下調基因TRINITY_DN22470_c0_g1(P=0.008)編碼DNA連接酶，具有連接和修復DNA的作用，基因下調表達說明細胞修復功能下降。B501處理組樣品中TRINITY_DN17049_c0_g2(P=3.19×10-7)基因上調，編碼鈣離子跨膜轉運蛋白，鈣離子信號轉導對細胞凋亡有重要的調節作用。但該基因的上調表達并未改變HG-11細胞凋亡被抑制的狀況(表1)。

表1 尖孢鐮刀菌HG-11差異表達基因的GO注釋及FPKM值

2.4.6 HG-11對B501脅迫的響應模式 B501對HG-11脅迫影響包括抑制細胞壁和細胞膜的合成，誘導細胞膜滲透性增加，入侵細胞破壞核糖體和線粒體這兩個重要的細胞器，并誘導產生活性氧造成細胞氧化傷害，最終導致細胞凋亡。為了應對B501抑菌物質的逆境脅迫，HG-11也運用多種響應手段。本研究綜合HG-11各類型基因表達狀況，可以看出，HG-11上調葡聚糖合成途徑的基因，提高葡聚糖或細胞壁的穩定性；上調麥角固醇合成途徑酶，膜靶向共翻譯蛋白，應對B501纖維素酶及其他抑菌物質對細胞壁的脅迫。HG-11上調表達脂肪酸合成酶以應對芽胞桿菌抑菌物質對細胞膜的破壞，維持細胞膜的穩定性，減少有害物質的入侵。B501抑菌物質進入細胞后對核糖體和線粒體進行破壞，HG-11上調酰胺合成基因、異檸檬酸脫氫酶以及細胞色素C氧化酶對核糖體和線粒體進行修復，同時抑菌物質在細胞內誘導產生活性氧，對細胞造成傷害，因此HG-11大量表達抗氧化酶類和谷胱甘肽轉移酶來消除活性氧，減輕傷害。HG-11細胞凋亡基因的上調表達，DNA連接酶等修復基因下調表達則表明芽胞桿菌抑菌物質能夠誘導細胞凋亡。由此可見，HG-11通過調節相應基因的表達以響應B501抑菌物質的脅迫作用。

3 討 論

本研究利用轉錄組測序技術分析尖孢鐮刀菌HG-11受到解淀粉芽胞桿菌B501脅迫后基因表達特征的變化。結果發現，HG-11通過改變B501的抑菌物質作用位點基因的表達來緩解或減輕脅迫傷害。

細胞壁是生物體防御逆境脅迫的第一道屏障。國外研究發現，引起植物枯萎病的尖孢鐮刀菌的細胞壁中總糖蛋白的含量占整個細胞壁重量的50%～60%，并位于細胞壁的最外層，內層由幾丁質和葡聚糖組成[26]。因此，病原真菌細胞壁的降解需要多種酶的共同作用。芽胞桿菌抗菌物質包括水解酶類如纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，脂肽類如環脂肽和其他脂肽類，其抗真菌作用機理包括抑制細胞壁合成、抑制細胞膜合成[27]、對細胞膜氧化傷害[28]、破壞核糖體和線粒體等細胞器、促進細胞凋亡等。B501能產生纖維素酶和淀粉酶。芽胞桿菌的纖維素酶抑制纖維素的形成，阻斷細胞壁合成，造成細胞壁破裂[29]。芽孢桿菌的淀粉酶能減少病原菌胞外多糖的分泌，降低病原菌的抗氧化活性[30]。而尖孢鐮刀菌細胞壁的糖蛋白和核糖體蛋白的抑制可能是由于B501產生蛋白酶的影響。TRINITY_DN67_c0_g1基因上調，該基因參與真菌細胞壁半纖維素木聚糖的生物合成，在緩解細胞壁傷害中能夠起一定作用。然而，該基因的上調表達并未改變細胞壁合成被抑制的狀況，導致菌絲高度畸形膨大，該現象類似于解淀粉芽胞桿菌MH71抗菌物質對番茄灰霉病菌菌絲的抑制，造成局部膨大或溢縮等[31]。細胞內固醇轉運相關的TRINITY_DN17937_c0_g1基因和膜轉運相關的TRINITY_DN3230_c0_g1基因上調表達，可能是HG-11通過促進麥角固醇生物合成以及調整細胞膜的流動性。脂肪酸是形成質膜的重要組成部分，維持細胞膜的流動性。TRINITY_DN18061_c0_g3等5個基因通過參與脂肪酸合成以及脂質的合成和代謝過程來維持細胞膜的滲透性和流動性。但本研究并未發現HG-11菌絲內含物泄漏，可能由于B501發酵液濃度低，產生的抑菌物質少，并未對HG-11細胞膜造成孔洞。

KEGG通路富集分析發現參與核糖體合成途徑的基因差異表達最顯著，B501處理組樣品中共有58個上調表達基因。Iglesias等[32]研究發現，尖孢鐮刀菌的抗性基因多位于編碼核糖體蛋白的基因上，核糖體能供給細胞蛋白質復合物，可能是HG-11努力維持核糖體的合成，改善蛋白質的產生，以緩解芽胞桿菌抑菌物質對蛋白質的降解作用。線粒體作為細胞內重要的細胞器，HG-11通過上調線粒體基因促進線粒體合成，并上調與三羧酸循環相關的基因促進線粒體產生ATP供給細胞能量。線粒體與ABC轉運蛋白協作，將ATP水解產生的能量與結合的底物轉出質膜，以緩解芽胞桿菌脂肽類抗菌物質的毒害作用，這與Fravel等[33]的研究結果相似，尖孢鐮刀菌體內的ABC轉運蛋白與致病性有關，可能在克服生防菌防御反應方面發揮作用。

B501對HG-11的脅迫效應可能造成活性氧自由基積累，從而對HG-11細胞造成傷害。通常，細胞通過抗氧化系統的活化包括過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等酶活性的提高，以及非酶抗氧化系統中抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)、還原型谷胱甘肽等物質含量的增加來清除氧自由基。B501處理組樣品中抗氧化相關基因上調表達，如POD基因、GSTs基因、APX基因和ABC轉運器基因等。POD是生物抗氧化防御系統中重要的酶，可以將細胞內超氧陰離子自由基還原為H2O2和氧，減緩和抵御細胞的傷害[34]。GSTs是一大類解毒酶，具有過氧化物酶的活性，在真核生物抗藥性和解毒方面起著重要作用[35]。APX是細胞內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，是清除H2O2的主要酶類[36]。真菌的ABC轉運器蛋白具有膜外排泵功能，能夠將有毒物質排到細胞外，在機體組織防御中起重要作用[37]。因此HG-11中抗氧化脅迫的酶類基因上調表達也會降低細胞內活性氧含量，維持細胞正常的生理活性，從而減少細胞凋亡。

雖然HG-11調節多個途徑的多個基因表達來響應B501發酵液中抑菌物質的脅迫，但并未改變HG-11細胞凋亡被抑制的狀況。細胞凋亡氧化修飾蛋白、細胞凋亡氧化應激蛋白、活性氧因子等與細胞凋亡相關的基因上調表達，再加上DNA連接酶等修復基因下調表達，導致菌絲高度畸形膨大，最終凋亡。近年來，生防微生物隨著可持續農業的發展日益受到重視，但其防效的不穩定性除去生存環境因素，可能與病原菌的抵抗性也有一定的關系[38]。后期應密切關注植物病原真菌對生防微生物的抗性發展，提高對生防菌與病原菌互作機制的認識，找到生防菌防治病原菌的靶標，從而實現精準高效防治。