豬源大腸埃希菌中質粒介導喹諾酮耐藥(PMQR)基因的多樣性研究

郭晶晶，侯思夢，劉連杰，邱 芳，劉曉強

(西北農林科技大學 動物醫學院，陜西楊凌 712100)

大腸埃希菌是人和動物的腸道共生菌，也是一種條件致病菌，能引起溫血動物的腹瀉，主要表現腸炎、腸毒血癥等多種臨床癥狀。豬大腸埃希病是養豬場最常見的細菌病之一，發病率和死亡率都較高，豬場一旦有發生就很難根除，給養豬業造成嚴重的經濟損失[1]。使用抗菌藥物一直是養殖場控制細菌性疾病的重要手段，但是致病菌和內源性微生物的耐藥性選擇壓力在過度使用或濫用抗菌藥物的背景下不斷增大，造成耐藥菌株在世界范圍內廣泛流行，且多重耐藥菌甚至超級耐藥菌時有報道，部分多重耐藥株可耐 12 種抗生素[2]。耐藥菌的產生和擴散不僅在很大程度上造成動物疫病防控難度加大，給養殖業造成巨大損失，也給食品安全和公共衛生安全帶來潛在威脅[3]。

氟喹諾酮類藥物是一類廣譜、高效的化學合成類抗菌藥物，在人醫臨床和動物臨床實踐中均發揮著重要作用[4-5]。然而，隨著此類藥物的廣泛使用，不規范用藥甚至濫用頻現，導致人類、動物及環境細菌耐藥性不斷增強。近些年的研究[6-8]顯示，大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥情況越來越嚴重。其耐藥機制主要包括喹諾酮類耐藥決定區(Quinolone resistance determining region, QRDR)靶基因突變、質粒介導喹諾酮類耐藥(Plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)基因、膜通透性下降以及藥物主動外排[9]。其中，PMQR基因可以介導耐藥性的水平傳播，并造成嚴重的公共衛生問題而受到越來越多的社會關注。耐藥基因位于質粒上使得耐藥基因在不同細菌間可以水平傳播，提高了耐藥基因的轉移率，使耐藥性菌株更易產生，而且這些基因可通過接合轉移導致細菌出現多重耐藥，這對臨床感染的控制提出了更高的要求，極大地增加了治療難度[10]。研究顯示，PMQR基因在醫院、動物甚至食品源均有檢出，且在動物源有極高的檢出率[11]。目前，對于陜西地區關于豬源大腸埃希菌PMQR基因的報道較少，本研究從陜西關中部分豬場采集肛拭子，分離鑒定大腸埃希菌。在藥敏試驗的基礎上，利用PCR擴增檢測耐氟喹諾酮類藥物的菌株中PMQR基因的種類及流行情況，同時利用PCR擴增和測序分析PMQR陽性菌株的QRDR突變情況，為耐藥性監測和豬場合理用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集 2017年4月-2018年11月，選取陜西關中地區不同的豬場，調查各豬場發病情況以及用藥情況。使用無菌棉拭子在生理鹽水中浸濕，插入待采樣仔豬的肛門2～3 cm，用棉拭子在肛門內輕輕擦涂，然后將拭子放入盛有生理鹽水的無菌離心管，再將無菌離心管放入0～4 ℃采樣箱帶回實驗室，4 h內進行大腸埃希菌的分離。每個肛門拭子樣品不能重復。

1.1.2 藥品與試劑 抗菌藥物阿莫西林、頭孢噻呋、阿米卡星、氟苯尼考、環丙沙星、恩諾沙星、土霉素、替米考星購自大連美倫生物科技有限公司；普多沙星購自美國拜耳動物保健品有限公司；美羅培南購自陜西標普醫藥科技有限公司。麥康凱培養基、伊紅美藍培養基、LB培養基和MH培養基購自北京索萊寶科技有限公司；PCR 相關試劑均購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 儀器 超凈工作臺(上海蘇凈凈化有限公司)；電熱恒溫培養箱(北京科偉永興儀器有限公司產品)；PCR儀(美國BIO-RAD)；水平電泳槽(北京六一儀器廠)；凝膠成像分析系統(北京元業伯樂科技發展有限公司)；壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 大腸埃希菌的分離、鑒定 參照參考文獻[12]的方法。將樣品稀釋并涂布至麥康凱培養板上，37 ℃培養24 h，然后挑取粉紅色菌落接種于伊紅美藍培養基，37 ℃培養18～24 h，進一步分離和純化，最后使用16S rRNA基因序列分析進行分子生物學鑒定。鑒定好的大腸埃希菌-80 ℃保存，備用。

1.2.2 藥敏試驗 按照CLSL推薦的微量稀釋法[13]，測定470株受試大腸埃希菌對6類10種抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)，大腸埃希菌ATCC 25922為質控菌。依據CLSL的抗菌藥物敏感性標準判定各菌株的敏感度，以敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)進行判定，對3類或3類以上抗菌藥物同時耐藥的菌株判定為多重耐藥菌。同時統計分析受試菌對受試藥物的耐藥率、MIC50和MIC90。

1.2.3PMQR基因及QRDR突變檢測 選取受試菌中對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株，提取DNA，PCR擴增檢測耐氟喹諾酮類的菌株中6種PMQR基因片段(qnrA、qnrB、qnrS、qnrD、aac(6′)-Ib-cr、qepA)的流行情況。PMG 252、PMG 298、PMG 306和J7261205為陽性對照菌株。對于PMQR基因陽性菌株，PCR擴增并測序分析其編碼DNA促旋酶的gyrA基因和拓撲異構酶Ⅳ的parC基因。相關引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

PCR反應體系為12.5 μL，包括ddH2O 4.5 μL、2×PCR Master 6 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃ 延伸5 min。PCR擴增產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后使用凝膠成像分析系統觀察結果。

表1 PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 大腸埃希菌的分離鑒定結果

肛拭子采集的樣品經分離培養基鑒別、革蘭氏染色鏡檢和16S rRNA測序分析，共獲得470株大腸埃希菌。

2.2 藥敏試驗結果

由表2可知，470株受試菌株對阿莫西林和土霉素的耐藥性最為嚴重，耐藥率達100%和 98.51%，其次為恩諾沙星、阿米卡星、環丙沙星、普多沙星、氟苯尼考、替米考星和頭孢噻呋的耐藥率分別達89.58%、60.64%、56.80%、57.66%、52.98%、50.85%和44.47%。沒有發現對美羅培南耐藥的菌株，但值得注意的是，9株大腸埃希菌對美羅培南的敏感性為中介。在470株受試大腸埃希菌中，89.58%為多重耐藥菌株。

表2 470株豬源大腸埃希菌的耐藥性

進一步的分析表明，阿莫西林的MIC50達512 μg/mL，阿米卡星、氟苯尼考、土霉素、替米考星的MIC50達256 μg/mL。3種氟喹諾酮類藥物和頭孢噻呋的MIC50相對較低，為8～32 μg/mL，美羅培南的MIC50最低，為0.063 μg/mL。

2.3 PMQR的流行性及QRDR突變分析

采用特異性引物，通過PCR擴增，對所有耐氟喹諾酮類藥物的菌株的6個PMQR基因的流行情況和QRDR突變進行檢測分析，結果見表3。對恩諾沙星、環丙沙星和普多沙星耐藥的421株大腸埃希菌中共有282株攜帶PMQR基因，其中qnrS基因的檢出率最高，為50%，aac(6′)-Ib-cr、qnrB、qnrA、qnrD和qepA基因的檢出率分別為36.52%、30.14%、17.38%、11.45%和 2.49%。55.30%(156/282)的菌株攜帶有1種PMQR基因，37.90%(107/282)攜帶有2種PMQR基因，6.40%(18/282)攜帶有3種PMQR基因，1(0.35%)株攜帶有4種PMQR基因，且所有攜帶PMQR基因的菌株均為多重耐藥菌株。在282株攜帶PMQR基因的菌株中，279(98.90%)株檢測到QRDR突變，其中以gyrA基因83位氨基酸突變(Ser83Leu)為主，同時部分菌株出現87位氨基酸突變(Asp87Asn)，132(46.80%)株攜帶PMQR基因的菌株的parC基因發生1個位點(Ser80Ile)或2個位點(Ser80Ile+ Glu84Val)突變，且發生parC基因突變的菌株均伴有gyrA基因的單位點或雙位點突變。此外，隨著菌株所攜帶PMQR基因的增多，gyrA和parC基因的突變位點也相應增加，如部分攜帶3個PMQR基因的菌株出現3個突變位點(Ser83Leu，Asp87Asn，Ser80Ile)或4個突變位點(Ser83Leu，Asp87Asn，Ser80Ile和Glu84Val)。

表3 豬源大腸埃希菌PMQR基因及QRDR突變檢測結果

3 討 論

本研究結果表明，陜西關中地區某些豬場分離的大腸埃希菌對臨床常用藥物已經產生較為嚴重的耐藥性，對氟喹諾酮類藥物恩諾沙星、環丙沙星和普多沙星的耐藥率也超過55%，其中對恩諾沙星的耐藥率最高，接近90%。另外，多重耐藥菌高達89.58%。多重耐藥菌比例的不斷增大以及多重耐藥菌的廣泛傳播，會極大地威脅養殖業的健康發展和公共衛生安全。藥敏試驗結果提示，大腸埃希菌對阿莫西林和土霉素均存在嚴重的耐藥性。而在受試的3種氟喹諾酮類藥物中，恩諾沙星的耐藥性高達89.50%，可能是恩諾沙星作為一種動物專用氟喹諾酮類藥物在臨床使用較為頻繁所導致，而普多沙星是一種近些年才上市的新型動物專用氟喹諾酮類藥物，尚未獲批用于食品動物，但其耐藥性已接近環丙沙星，阿米卡星、氟苯尼考、環丙沙星和替米考星的耐藥性則趨于嚴重，在臨床使用中應引起重視。本研究受試菌株對美羅培南仍然保持較高的敏感率，美羅培南作為一種碳青霉烯酶抗生素，并未獲批廣泛用于食品動物，然而，有9株受試菌對其敏感性明顯下降，已處于中介，臨床上要引起足夠重視。

大量研究表明，PMQR基因通常位于大小不等的可接合質粒上，其耐藥機制主要包括，qnr基因調控DNA解旋酶活性機制，aac(6′)-Ib-cr基因編碼乙酰基轉移酶修飾喹諾酮類機制以及qepA介導蛋白質主動外排機制[11]。本研究結果顯示，對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株中，qnrS、aac(6′)-Ib-cr、qnrB、qnrA、qnrD和qepA基因的檢出率分別為50%、36.52%、30.14%、17.38%、11.35%和2.49%。可以看出，PMQR基因在此次采集的豬場的試驗樣本中種類較多，且流行廣泛。PMQR基因存在地域差異，在同一區域內不同養殖場或不同種屬動物的流行也有差異。王麗娟等[6]發現在陜西牛源大腸埃希菌中也以qnrS和aac(6′)-Ib-cr最為流行，但是未檢測到qnrA、qnrD和qepA基因。楊艷麗等[14]在研究中發現新疆地區牛源大腸埃希菌中主要攜帶qnrA、qnrS和aac(6′)-Ib-cr3種耐藥基因，以qnrA基因(12.07%)檢出率最高。田亞凱[15]發現犬源大腸埃希菌主要攜帶oqxA、oqxB和qnrS3種耐藥基因，其中qnrS基因(14.70%)最為流行。坤清芳等[16]報道四川省兔源大腸埃希菌中aac(6′)-Ib-cr檢出率最高，達80.4%，其他PMQR基因qnrD、qnrS、oqxA和oqxB檢出率也較高，分別達59.8%、59.8%、63.9%和51.5%。Oliveira等[17]在排放的廢水和重復使用的廢水中都檢測到高濃度的qnr基因。此外，國內外醫院的人源樣品中，PMQR基因也都有較高的檢出率[18-22]。由此可見，PMQR基因廣泛存在于各種動物、人體以及環境中。然而，PMQR基因的種類及數量隨著地區、樣品來源的不同而具有較大差異，這可能與不同地區抗菌藥物的用藥背景、飼養環境、以及種屬體質的不同有關。實際上，大腸埃希菌對喹諾酮類藥物耐藥的最主要機制是QRDR突變，且突變位點數量與耐藥水平呈正相關。本研究中421株對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株中，有282株攜帶有PMQR基因，說明還存在其他機制。同時98.90%的PMQR陽性菌株發生QRDR突變，且靶基因gyrA和parC的突變位點數目與PMQR的數目以及耐藥水平之間存在關聯。雖然PMQR基因的出現并不是細菌對喹諾酮類藥物耐藥的決定因素，但其可以提高耐藥水平，并通過質粒介導而在不同種屬菌株水平傳播，從而加速耐藥性的傳播和蔓延。然而，菌株中QRDR靶基因突變和獲得PMQR基因的先后順序會影響耐藥性的發展，如果菌株發生靶基因突變再捕獲PMQR基因，可迅速促進耐藥的發展[23]。

PMQR基因的多樣性、快速的水平傳播能力及其和QRDR之間可能存在協同作用，增加了臨床使用氟喹諾酮類藥物治療的不確定性。同時，應不斷增強對多重耐藥菌的防控意識，加強PMQR耐藥基因和QRDR突變的檢測，合理選擇抗菌藥物并合理聯合用藥，對于預防并控制耐藥基因的傳播具有重要意義。此外，及時處理舍內糞便，提高飼養管理水平，也有助于減緩、防止多重耐藥情況的發生。