鹽酸可樂定人工抗原及其鼠源多抗的制備

王 耀，曹金博，曹夕丹，李鐵梅，邢云瑞，孟繼秋,，龐杏豪,，孫亞寧,陳秀金，李兆周，胡驍飛

(1.河南科技大學 食品與生物工程學院，河南洛陽 471003；2.河南省農業科學院 動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002；3.西北農林科技大學 動物醫學院，陜西楊凌 712100；4.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176)

鹽酸可樂定(Clonidine hydrochloride，CLO)屬于α2腎上腺受體激動劑，化學名為[2-(2,6-二氯苯基)亞氨基]咪唑啉，其結構式如圖1-A所示，臨床上主要用于治療高血壓、偏頭痛、絕經期潮熱、痛經等病癥，將其與中樞神經抑制藥合用，可產生協同抑制作用，與降壓藥合用可加強降壓作用[1-3]。CLO為咪唑啉的衍生物，可刺激垂體分泌生長激素，將其添加在禽畜飼料或者飲水中可在很大程度上促進禽畜生長，并改善營養代謝途徑，重新分配脂肪肌肉比例，從而起到提高瘦肉率的作用[4-5]，被視為一種新型的瘦肉精類藥物。有研究表明，CLO具有極大的毒副作用，人食用含CLO殘留的動物源性食品后，食品中殘留的CLO將在體內大量蓄積，嚴重危害人身健康，其導致的中毒癥狀主要包括口干、嗜睡、頭痛、惡心、嘔吐、便秘、心悸、精神抑郁等[6-7]。因此，原農業部1519號公告中嚴令禁止在養殖過程中添加CLO。但出于經濟利益驅使，目前仍有一些在家畜養殖中違法使用CLO的現象。因此，建立CLO殘留的簡便、快速、準確、靈敏和高通量的檢測方法尤為重要，對保障動物源性食品安全具有重要的現實意義。

目前關于CLO殘留的檢測方法主要包括高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)[8]、氣相色譜法(Gas Chromatography，GC)[9]、高效液相色譜—串聯質譜法(High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS)[10]等，此類檢測方法雖然檢測精確度較高，假陽性和假陰性率較低，但需要的儀器較為昂貴，需要專業培訓的操作人員和一定的圖譜分析能力，同時樣品的前處理過程較為復雜，不利于運輸中易受損樣品和現場高通量樣品的快速篩查[11]。近年來，基于抗原抗體特異性結合的免疫分析檢測技術發展迅速，在農獸藥殘留、病原檢測等領域廣泛應用。其中經典的酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)不僅操作簡單、快速，而且具有較高的靈敏度和準確度，可克服色譜檢測技術的部分應用局限[12-14]。基于免疫層析技術和膠體金示蹤技術發展起來的膠體金免疫層析試紙(Colloidal gold immunochromatographic strip，ICS)，可對樣品實現5～10 min肉眼可見的快速檢測，特別適合基層對樣品的高通量快速篩查[15-17]。CLO分子質量較小，無免疫原性，需通過與蛋白載體偶聯形成半抗原—載體復合物才能刺激機體產生相應的免疫應答反應，但CLO分子結構上無可用于偶聯載體的活潑基團，無法與載體蛋白偶聯。ACLO為CLO的衍生物(圖1-B)，基于結構類似物的交叉反應性原理，可以選擇ACLO為半抗原，利用其分子結構苯環上活潑的氨基基團，采用重氮化法合成CLO人工抗原。本研究以ACLO為半抗原，利用其苯環4位上的氨基，采用重氮化法將氨基重氮化與蛋白載體偶聯，合成免疫原性良好的CLO人工抗原，免疫BALB/c小鼠后，獲得免疫學特性較好的CLO鼠源多抗，為制備高親和力CLO單克隆抗體以及建立其免疫學檢測方法奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑 ACLO(純度≥98%)，購自中國食品藥品鑒定研究所；CLO、苯乙醇胺A(Phenylethanolamine A，PA)、巴氯芬(Baclofen，BA)、沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)、萊克多巴胺(Ractopamine，RAC)、弗氏完全佐劑(Freund’s Adjuvant Complete，FCA)、弗氏不完全佐劑(Freund's Adjuvant Incomplete，FIA)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、雞卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)，均為Sigma公司產品；HRP標記的羊抗鼠IgG(Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG，GaMIgG-HRP)為Jackson ImmunoResearch公司產品；其他試劑均為市售分析級試劑。

1.1.2 溶液 包被液(pH 9.6的0.05 mol/L NaHCO3/Na2CO3緩沖液，CBS)；稀釋液(pH 7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，PBS)；洗滌液[V(PBS)∶V(Tween20)=2×103∶1，PBST]；封閉液[V(PBST)∶V(脫脂奶粉)=20∶1]；顯色液(TMB)；終止液(2 mol/L的H2SO4溶液)均由河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室配制。

1.1.3 儀器 BSA224S型電子天平，德國Sartorius公司；Multiskan FC型酶標儀和UV-5100H型紫外—可見分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司；Vortex2型振蕩器和 T8.10高速均質乳化機，艾卡儀器設備有限公司；SZCL-2型控溫磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；HPX-9052MBE型恒溫培養箱，上海博迅實業有限公司；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司。

1.1.4 試驗動物 6周齡SPF級BALB/c小鼠，購自河南省實驗動物中心。

1.2 方 法

1.2.1 人工抗原合成 采用重氮化法[18]合成CLO人工抗原，其中免疫原(CLO-BSA)的合成路線圖如圖2所示。稱取3 mg ACLO溶于0.5 mL 0.1 mol/mL的稀鹽酸溶液中，向該溶液中逐滴攪拌滴加0.2 mol/mL的NaNO2溶液至用淀粉碘化鉀試紙檢測變藍時為止，并用適量100 mg/mL的氨基磺酸溶液終止反應(反應全程0～4 ℃避光)。然后稱取2.5 mg BSA溶于1 mL CBS緩沖液中(蛋白液)，將上述反應液逐滴攪拌滴加在該蛋白液中，室溫避光攪拌反應4 h。最后將反應液轉移至潔凈透析袋中，4 ℃條件下用PBS攪拌透析3 d。透析結束后，離心去除沉淀得免疫原(CLO-BSA)，-20℃保存，備用。包被原(CLO-OVA)制備方法同上。

1.2.2 人工抗原鑒定 紫外掃描鑒定：用PBS緩沖液配置BSA標準品溶液和CLO標準品溶液，使其濃度分別與人工抗原濃度一致。然后利用全波長紫外—可見分光光度計分別對各溶液進行掃描，根據紫外光譜中人工抗原特征吸收峰相比載體蛋白和BSA標準品的變化判斷人工抗原偶聯效果。

SDS-PAGE鑒定：參照文獻[19]配制電泳所需濃縮膠和分離膠，選擇的濃縮膠和分離膠體積分數分別為5%和12%，電泳的電壓分別為60 V和90 V，上樣量為10 μL(含人工抗原5 μg)。考馬斯亮藍染液染色3～4 h，脫色液脫色6 h，用凝膠成像儀拍照，根據蛋白條帶位置差異判斷偶聯效果。

1.2.3 多抗的制備與鑒定 用合成的免疫原(CLO-BSA)免疫4只SPF級6周的齡雌性BALB/c小鼠，采用背部皮下多點注射方式進行免疫。首免為基礎免疫，用滅菌PBS稀釋CLO-BSA后與FCA等體積混合，用乳化器充分乳化后以每只200 μL(含免疫原30 μg)的劑量免疫小鼠，首免21 d后進行3次加強免疫，每次間隔21 d，其中免疫佐劑使用FIA代替FCA。在第4 次免疫10 d后斷尾采血，用PBS稀釋100倍，離心去除沉淀后，以包被原(CLO-OVA)包被ELISA板鑒定其免疫學特性。

多抗效價測定：采用間接ELISA方法(i-ELISA)[20]測定多抗效價，具體操作為：首先將包被原CLO-OVA用CBS包被緩沖液稀釋后每孔100 μL包被于96孔ELISA板中，在4 ℃條件下包被過夜，然后用PBST洗滌液洗板并甩干液體，最后每孔加入250 μL封閉液在37 ℃條件下封閉1 h，洗板甩干后于4 ℃保存，備用。檢測時，取包被好的ELISA板，每孔加入100 μL倍比稀釋的多抗，以小鼠陰性血清為陰性對照，PBS為空白對照，在37 ℃條件下孵育15 min；洗板甩干后加入用封閉液稀釋1 000倍的HRP標記的羊抗鼠IgG，37 ℃條件下孵育30 min；洗板后每孔加入100 μL顯色液(TMB)，室溫避光顯色10 min，最后加100 μL終止液終止反應，用酶標儀讀取OD450nm。陽性判定標準為：待測孔OD450nm大于0.2，并大于空白孔OD450nm的2.1倍。以陽性孔最小OD450nm所對應的多抗稀釋倍數作為效價。

多抗敏感性鑒定：采用間接競爭ELISA方法(ic-ELISA)[21]鑒定多抗敏感性，具體操作為：取包被好的ELISA板，首先每孔加入100 μL不同濃度梯度的CLO標準品溶液，然后加入一定倍數稀釋的多抗(效價測定時OD450nm為1.2左右)，在37 ℃條件下孵育15 min。其他操作步驟與多抗效價測定操作相同。以抑制率(B/B0)為縱坐標(其中B為陽性孔的OD450nm，B0為CLO濃度為零時的OD450nm)，以CLO濃度的對數值為橫坐標，繪制標準抑制曲線，最后根據抑制曲線獲得的線性回歸方程計算半數抑制質量濃度(Half inhibitory concentration，IC50)，并以此來評定多抗的敏感性。

多抗特異性鑒定：選擇PA、BA、SAL、RAC等瘦肉精類藥物作為競爭物，采用ic-ELISA法測定各競爭物對多抗的IC50。以CLO的IC50與各競爭物的IC50的百分比作為交叉反應率(Cross reactivity，CR%)，CR越低，則說明多抗的特異性越強[22]。

1.3 數據處理

對所得的數據利用Excel進行處理并繪圖，對分子結構式及合成路線圖用ChemDraw Pro 18.0進行繪制。

2 結果與分析

2.1 人工抗原鑒定

2.1.1 紫外掃描鑒定結果 采用重氮化法合成CLO人工抗原，用紫外掃描法鑒定其偶聯效果，結果如圖3所示。從紫外掃描圖譜中可以看出，BSA和OVA在280 nm處左右有明顯的特征吸收峰，CLO在225 nm和270 nm處出現特征吸收峰，而合成的人工抗原(CLO-BSA和CLO-OVA)的特征吸收峰相比載體蛋白和CLO均發生明顯偏移，特征吸收峰偏移是由于靶標與載體蛋白偶聯改變了原有的化學基團并形成了新的基團所致，進而初步證明人工抗原偶聯成功。

2.1.2 SDS-PAGE鑒定 采用SDS-PAGE對人工抗原的偶聯效果進行進一步鑒定，結果如圖4、圖5所示。從圖中可看出，CLO-BSA電泳條帶遷移的位移小于BSA，具拖尾現象，說明其分子質量大于BSA，證明ACLO成功偶聯到BSA上；CLO-OVA的電泳條帶遷移的位移小于OVA，同樣證明ACLO成功偶聯到載體蛋白(OVA)上。

2.2 多抗制備及鑒定

2.2.1 多抗效價測定 利用i-ELISA方法測定多抗效價，結果如表1所示。利用免疫抗原免疫的4只小鼠所獲得的多抗效價均達到1∶25 600以上，其中4號小鼠多抗效價更高，免疫效果更好。效價測定結果表明，免疫原成功刺激小鼠機體免疫應答，產生相應抗體。

表1 效價測定結果

2.2.2 敏感性鑒定 利用ic-ELISA方法鑒定多抗的敏感性，結果如表2所示。免疫的4只小鼠所獲得的多抗均能夠特異性識別并結合CLO，CLO對4只小鼠多抗的IC50分別為81.360、7.026、47.474和34.086 ng/mL，其中2號小鼠多抗敏感性最好，其抑制曲線線性回歸方程為y=-0.146 8x+0.624 3，R2=0.991(圖6)，x表示log10CLO質量濃度，y表示抑制率。因此，可選擇2號小鼠脾細胞作為細胞融合對象，后期可通過細胞融合及單克隆抗體篩選技術制備單克隆抗體。

表2 間接競爭ELISA鑒定結果

2.2.3 特異性鑒定 選擇敏感性最好的2號小鼠多抗，以其他瘦肉精類藥物(PA、BA、SAL、RAC)作為競爭物，利用ic-ELISA方法鑒定多抗特異性。特異性鑒定結果如表3所示，多抗與PA、BA、SAL、RAC均不存在交叉反應，具有較高的特異性，在實際樣品檢測中可有效排除其他瘦肉精類藥物的干擾。

表3 多抗與競爭物的交叉反應

3 討 論

3.1 人工抗原合成

CLO分子質量較小，屬于小分子半抗原，無法直接刺激機體產生免疫應答反應，需要連接到大分子載體上才能獲得免疫原性。通常選擇溶解性好，且含有大量活潑基團(羧基和氨基)的BSA和OVA作為載體蛋白，而且BSA和OVA同源性較差，選擇BSA作為免疫原載體，而OVA作為包被原載體，可有效排除載體蛋白本身對鑒定多抗敏感性和特異性的影響。在選擇人工抗原合成方法時，若靶標分子含有羧基、氨基、羰基、羥基、巰基和芳香胺等基團，則可采用碳二亞胺法、戊二醛法、混合酸酐法、重氮化法等方法進行偶聯。若半抗原分子結構中無活潑基團，則可先通過分子改造引入活潑基團，或基于結構類似物的交叉反應性原理，選擇靶標分子結構類似物為半抗原進行偶聯。CLO分子結構上無可用于連接的活潑基團，李丹妮等[2]以CLO的衍生物ACLO為半抗原，利用琥珀酸酐法對苯環4位氨基基團進行改造，引入羧基基團，進而利用碳二亞胺法合成CLO人工抗原。筆者曾采用過此方法，但對半抗原改造時條件不易控制，合成的人工抗原未達到預期的免疫效果。本研究同樣從苯環4位的氨基基團出發，采用重氮化法，將氨基基團重氮化后直接偶聯到載體蛋白上，通過免疫BALB/c小鼠，獲得了針對CLO敏感性高和特異性強的多抗，證明此方法合成的CLO人工抗原具有較好的免疫原性。

3.2 人工抗原質量鑒定

鑒定人工抗原偶聯效果，通常采用物理和化學方法，如紫外掃描、SDS-PAGE、紅外掃描、質譜鑒定等。紅外掃描和質譜鑒定可準確分析分子基團的變化，但操作較為繁瑣，儀器較為昂貴。紫外掃描和SDS-PAGE鑒定方法雖然操作簡單，但準確度不如紅外掃描和質譜鑒定。物理和化學鑒定方法僅能初步鑒定人工抗原的偶聯效果，筆者在采用琥珀酸酐法和碳二亞胺法合成CLO人工抗原時，采用紫外掃描和SDS-PAGE均鑒定CLO偶聯到載體蛋白上，但免疫小鼠后獲得的多抗血清雖然效價很高，但并不能特異性的識別CLO，原因可能如下：CLO半抗原在人工抗原偶聯過程中，決定其免疫原性的抗原決定簇的結構發生了改變，也就意味著免疫小鼠后產生的抗體不一定完全是針對CLO的，或者是抗原決定簇并未充分地暴露，從而導致多抗血清表現出較強的非特異性。因此，在人工抗原偶聯方法選擇時，應盡量避免改變CLO的抗原決定簇結構，盡量使其充分暴露，并通過免疫動物，鑒定多抗是否能特異性識并結合CLO來最終驗證人工抗原的偶聯 效果。

4 結 論

本研究采用重氮化法成功合成免疫原性良好的CLO人工抗原，免疫BALB/c小鼠后獲得效價高達1∶25 600以上的鼠源多抗血清，獲得的多抗血清能特異性識別CLO，具備較高的敏感性(IC50=7.026 ng/mL)，同時與其他瘦肉精類藥物無交叉反應，特異性良好，為CLO高親和力單克隆抗體的制備以及ELISA和ICS檢測方法的建立奠定良好的基礎。