版納微型豬近交系ZPBP2基因的克隆及生物信息學分析

查星琴，成文敏，李海昌，潘偉榮，霍金龍，黃 英

(1.云南農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201；2.云南農業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201;3.云南農業(yè)大學 云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南 昆明 650201)

哺乳動物精子進入卵子完成受精的生理過程非常精密和復雜，精子首先必須特異性地與卵子的透明帶(Zona pellucida，ZP)結合，經歷頂體反應，穿越透明帶，才能和卵母細胞融合，完成受精[1]。精卵質膜融合是這一生理過程中最為關鍵的步驟，很多吸附在精子表面的精漿蛋白及雌性生殖道分泌的因子均在精卵質膜融合中發(fā)揮重要的調控作用[2-3]。透明帶結合蛋白(zona pellucida binding protein，ZPBP)是精子表面能與卵子透明帶相結合的蛋白分子，包括透明帶結合蛋白1(zona pellucida binding protein 1，ZPBP1)和透明帶結合蛋白2(zona pellucida binding protein 2，ZPBP2)，參與精子早期結構的形成和精卵融合過程。在大鼠、小鼠、豬、人[4]的精子中研究發(fā)現，ZPBP1基因只在人、小鼠和豬的睪丸組織表達，ZPBP2基因除了在人、小鼠和豬的睪丸組織表達，在豬精囊腺和附睪尾均有表達，且在睪丸中表達豐度最高[5]。ZPBP1和ZPBP2基因主要參與精子與卵子的細胞外基質次級互作[6]，在精子發(fā)生中可能參與精子結構形成[7]，對精子頂體形成和形態(tài)發(fā)生發(fā)揮重要作用，可見其在雄性不育的發(fā)生中起著十分重要的作用。

版納微型豬近交系(BMI)是云南農業(yè)大學曾養(yǎng)志教授對連續(xù)20多代采用全同胞或親子交配等高度近交方法，經嚴格選擇、精心培育成功的大型哺乳動物近交系。BMI遺傳背景清楚，基因高度純合，實驗可重復性高，是動物模型建立、轉基因動物生產、生物醫(yī)學實驗及異種器官移植等研究最為理想的實驗動物。但BMI雄性動物普遍存在繁殖力低的現象，影響近交系動物的培育進程。因此，研究ZPBP2基因在雄性不育中的作用具有十分重要的意義。本研究使用RT-PCR方法擴增并克隆出BMI的ZPBP2基因，對其進行生物信息學分析，旨在揭示ZPBP2基因的生物學特性，為進一步深入探索BMI 弱精和繁殖力下降的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

采集云南農業(yè)大學版納微型豬近交系重點實驗室昆明豬場成年(15月齡) BMI不育公豬睪丸組織，液氮速凍，置于-80 ℃以備RNA提取。

所用試劑Competent Cell Preparation Kit、DL2000、RT-PCR一步法試劑盒、病毒總RNA/DNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0)、TaKaRa Ex TaqTMTaq酶、逆轉錄酶XL(AMV)等均購自寶生物工程(大連)有限公司，DNA純化試劑盒購自全式金生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 合成引物 參照Genbank公布的豬ZPBP2基因(基因登錄號GQ369764和GQ369765)的保守序列，應用 Primer Premier 5.0 和 Oligo 6.0 軟件設計特異性引物，由上海生工有限公司合成，引物序列為：5′-CAAAGCAGAAACCCAAGA-3′；5′-CACCTCCACAAGCAAGTA-3′。擴增片斷長度約為479 bp。

1.2.2 RNA的提取 稱取大約100 mg的BMI睪丸組織樣品，按 TaKaRa 公司的RNA Plus說明書步驟提取總RNA，用核酸蛋白測定儀測定其濃度及純度，稀釋成200 ng/μL，取5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。

1.2.3 cDNA合成 將檢測合格的總RNA樣品反轉錄為cDNA，反轉錄體系為：在0.2 mL的PCR管中加入Total RNA樣品2 μg(10 μL)，50 μmol/L oligo(dT)18 1 μL,10 mmol/L dNTP 1 μL,混勻后70 ℃孵育5 min，迅速放在冰上冷卻；稍微離心后再加入5×first buffer 4 μL，recombiant RNase inhibitor 1 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，輕微混勻后37 ℃孵育 2 min，室溫下加入1 μL的 reverse transcriptase M-MLV(200 u/μL)，輕輕吹打混勻，37 ℃孵育10 min，最后42 ℃下將其加熱1 h終止反應，產物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4ZPBP2基因PCR擴增反應體系與程序 PCR反應總體系為25 μL：12.5 μL的Premix Taq，8.5 μL的ddH2O，上下游引物(10 pmol/μL)各1.5 μL，1 μL的cDNA模板(25 ng/μL)，輕微混勻。PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 8 min。產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測效果，紫外凝膠成像系統(tǒng)(SYGENE，GeneGenius)照像。

1.2.5ZPBP2基因克隆 參照DNA純化回收試劑盒(全式金生物技術有限公司)說明書步驟進行PCR產物回收純化，取一份純化產物送上海生工有限公司測序，另取一份純化產物連接入pMD18-T克隆載體，構建10 μL反應體系：目的片段4 μL，pMD18-T克隆載體1 μL，Ligation mix 5 μL。16 ℃連接10 h后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于LB瓊脂固體培養(yǎng)基上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)中過夜培養(yǎng)形成單菌落，挑出白色陽性菌落于含有AMP的LB液體培養(yǎng)基中震蕩過夜培養(yǎng)(37 ℃，200 r/min)，進行菌液PCR鑒定，然后送上海生工有限公司測序。

1.2.6ZPBP2基因序列的生物信息學分析 測序結果用NCBI(National Center for Biotechnology Information)的nucleotide blast軟件檢驗核苷酸的序列；用Generunr軟件預測出開放閱讀框，并得到相應的氨基酸序列；用在線分析軟件ExPASy-PrtPram tool分析ZPBP2基因編碼的蛋白質結構；通過NetNGlyc 1.0 Server預測蛋白質N-糖基化位點；通過NetOGlyc 4.0 Server預測蛋白質O-糖基化位點；通過NetPhos 2.0 Server預測蛋白質磷酸化位點；通過SignalP 4.1 Server預測信號肽序列；通過TMpred server預測蛋白質中是否有跨膜結構域；用Lasergene軟件分析核苷酸的同源性。

2 結果與分析

2.1 ZPBP2基因擴增結果

ZPBP2引物擴增的特異性片段為479 bp，與預期片段長度相一致(圖1)。測序結果與GenBank上豬ZPBP2基因序列比較，可以初步確定擴增序列為BMI的ZPBP2基因序列。

圖1 ZPBP2引物擴增的PCR產物2%瓊脂糖電泳結果M. DL2000 Marker；1. ZPBP2引物擴增片段Fig.1 2% Agarose gel electrophoresis results ofprimer ZPBP2 PCR productsM. Marker-DL2000；1. PCR product amplified by primers ZPBP2

2.2 ZPBP2基因序列生物信息學分析

用ExPaSy ProtParam在線分析軟件預測BMIZPBP2的氨基酸序列，結果顯示ZPBP2基因編碼蛋白分子量為17.4798 kD，理論等電點為5.63；BMI ZPBP2氨基酸組成上，酸性氨基酸(Asp+Glu)有19個；堿性氨基酸(Lys+Arg)有14個，說明該蛋白為酸性蛋白質，其中以半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、纈氨酸(Val)等含量較高，各占總氨基酸數的7.0%。ZPBP2蛋白質不穩(wěn)定指數為52.77，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數為66.43，總的親水性平均系數(Grand average of hydropathicity ，GRAVY)為-0.193，具有弱疏水性。采用SignalP 4.1對ZPBP2蛋白進行跨膜結構預測，結果表明ZPBP2蛋白中沒有跨膜信號肽位點(圖2)；用NetOGly4.0和NetNGly1.0進行預測的結果顯示ZPBP2蛋白沒有O-糖基化位點，在第32和第68位氨基酸各有一個N-糖基化位點是NGSV和NKTL(圖3)。

圖2 ZPBP2蛋白跨膜信號肽位點預測Fig.2 Predicted transmembrane signalpeptide sites in protein ZPBP2

圖3 ZPBP2蛋白N-糖基化位點預測Fig.3 Predicted N-glyoosylation sites in protein ZPBP2

利用NetPhos 2.0在線系統(tǒng)預測表明，BMI ZPBP2蛋白有5個磷酸化位點，其中3個絲氨酸(Ser)磷酸化位點(A34、A88、A116)、1個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(A4)、1個酪氨酸(Tyr)活性位點(圖4)。

圖4 ZPBP2蛋白磷酸化位點推測圖Fig.4 Predicted Phosphorylation sites in protein ZPBP2

測序結果經 GenBank 上 Nucleotide Blast檢驗，結果(圖5)顯示，在第809位、第854位、第872位分別有A-G、C-T、C-T 3個突變位點；經推導氨基酸序列分析(圖6)得出，只有第809位A-G的突變是有義突變，即將絲氨酸突變?yōu)楦拾彼帷?/p>

圖5 ZPBP2基因核苷酸序列比對Fig.5 Alignment of nucleotide sequences of ZPBP2

圖6 ZPBP2基因推導氨基酸序列比對Fig.6 Alignment of deduced amino acid sequences of ZPBP2

利用SWISS-MODLE軟件構建BMI ZPBP2蛋白三級結構模型(圖7)，通過分析可知預測模型序列與模板序列形成的蛋白質三級結構基本一致，僅扭轉角分布不一樣，空間構象可能存在細微差異。

圖7 ZPBP2的三級結構Fig.7 The tertiary structure of ZPBP2

將BMI ZPBP2 的蛋白質序列與普通豬、牛、綿羊、馬、人等6個物種的蛋白質序列導入 MegAlign 計算相似度(圖8)，相似度分別為99.4% 、90.0% 、88.1% 、87.9% 、85.2%。再將這6條序列導入MEGA7構建系統(tǒng)進化樹(圖9)，結果表明版納微型豬近交系豬與普通豬遺傳距離最近，而與綿羊在進化樹中距離最遠?？梢?，版納微型豬近交系首先與普通豬聚為一類。

圖8 ZPBP2基因核苷酸相似度分析Fig.8 ZPBP2 nucleotide similarity analysis

圖9 版納微型近交系豬ZPBP2基因進化樹分析Fig.9 Evolutionary tree for Banna inbred pig ZPBP2 gene

3 討 論

ZPBP作為一類重要的功能蛋白，是調控精子發(fā)生、成熟和精卵融合的重要生物分子，從蛋白質和基因水平研究其生物功能有助于進一步揭示精子發(fā)生、成熟以及受精的分子機制，從而為臨床上免疫性不育的治療及新型避孕疫苗的開發(fā)開辟新的途徑。ZPBP1最早在豬的精子提取物中被鑒定[8]，定位于精子的整個頂體，ZPBP2為ZPBP1的旁系同源蛋白，ZPBP2在早期精子細胞中僅限于頂體顆粒中，后期出現在頂體吻脊中。關于ZPBP的生物功能研究一直僅局限于參與精子與卵子透明帶的結合，直到2007年Lin等[7]研究發(fā)現敲除ZPBP1基因的雄性小鼠表現為無生育力，超微結構研究表明缺失ZPBP1基因會破壞精子細胞與支持細胞的連接；敲除ZPBP2基因的雄性小鼠超微結構顯示精子穿越透明帶的能力降低并伴有異常的精子頂體膜內陷，表現為生育力低下。這些結果提示，ZPBP不僅參與精卵結合，而且有助于精子的早期結構形成[7]。

利用 RT-PCR技術，本研究擴增了BMIZPBP2基因的部分編碼區(qū)和部分非編碼區(qū)系列，成功克隆得到BMIZPBP2基因，序列長度為479 bp，結果表明ZPBP2基因核苷酸序列在第809位A-G、第854位C-T和第872位C-T分別有3個突變位點，但只有第809位A-G的突變是有義突變，即氨基酸由絲氨酸突變?yōu)楦拾彼?。這種有義突變是否會改變蛋白質的結構、繼而影響ZPBP2蛋白的結構和功能還待以后進一步研究才能確定。BMI ZPBP2預測模型序列與模板序列形成的蛋白質三級結構基本一致，空間構象可能存在細微差異。

蛋白質磷酸化在調控蛋白質活力和功能的過程中發(fā)揮著重要作用，在推導的氨基酸序列中存在5個磷酸化位點，其中3個絲氨酸(Ser)磷酸化位點(A34、A88、A116)、1個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(A4)、1個酪氨酸(Tyr)活性位點，在ZPBP2蛋白參與精子發(fā)生過程中，這些氨基酸基序可能發(fā)揮了重要的作用。另有研究表明，酪氨酸磷酸化可能參與精子獲能和頂體反應[8-10]。在BMI ZPBP2蛋白序列中只存在1個潛在的酪氨酸磷酸化位點，且在哺乳動物ZPBP2蛋白中保守，是否由于酪氨酸磷酸化位點較少，導致對蛋白的修飾和調控較少，才引起B(yǎng)MI公豬繁殖力低下仍需下一步深入研究。

ZPBP2蛋白質屬于不穩(wěn)定蛋白，具有弱疏水性。ZPBP2蛋白沒有跨膜信號肽位點和O-糖基化位點，在第32和第68位氨基酸各有一個N-糖基化位點是NGSV和NKTL。

不同物種核苷酸相似度分析表明，BMI的ZPBP2與非近交系豬相似度最高為99.4%，與人相似度較低為85.2%，ZPBP2進化上比較保守，核苷酸物種間相似性較高；系統(tǒng)進化樹表明，在親緣關系上與普通豬同處于一個分支，親緣關系較近，與綿羊親緣關系較遠，表明ZPBP2基因具有相對的種屬特異性，親緣關系越近，同源性越高。

4 結 論

成功擴增了ZPBP2基因部分編碼區(qū)序列，序列長度為 479 bp，BMI與普通豬核苷酸相似度較高，同處于一個分支中，親緣關系較近，與綿羊親緣關系最遠。本研究結果可為進一步研究BMIZPBP2基因的功能和闡明BMI公豬弱精癥機理奠定基礎。