海南省白沙黎族自治縣2020年新生兒地中海貧血基因攜帶情況及其特點分析

石海杰，趙振東

地中海貧血（thalassemia，以下簡稱地貧）又稱為海洋性貧血，是最常見的單基因常染色體隱性遺傳病，主要包括α地貧和β地貧兩種類型。其共同特點是由于機體血紅蛋白α鏈或β鏈合成減少，使紅細胞不能攜帶足夠的氧氣，導致患者幼兒時期便有貧血相關癥狀出現并持續終生[1]，多數患者病癥為慢性進行性溶性貧血[2]。部分特定人群少樣本量研究[3-5]已經證實海南省是地貧的高發地區，但縣級以上規模人群地貧基因篩查相關的報道較少，因此，現將涵蓋白沙黎族自治縣（以下簡稱白沙縣）新生兒地貧基因攜帶情況及其特點報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取在海南省白沙縣各助產單位2020年出生的新生兒作為研究對象，采取知情同意自愿原則，即所有新生兒監護人簽署了知情同意書后再進行樣本采集。在932例新生兒當中共收集到912例樣本，其中男507例、女405例。本研究經海南省婦女兒童醫學中心倫理委員會審核批準〔倫申第（028）號〕。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 按照《新生兒疾病篩查血片采集技術規范》（WS376.3-2013）要求，采集出生滿3～20 d 的新生兒足跟血，垂直滴于新生兒篩查采集卡上制成直徑>5 mm的3～4個血斑，自然晾干后的干血斑密閉封口袋內置于2～8 ℃冰箱暫存，定期送至海南省新生兒疾病篩查中心待檢。

1.2.2 實驗儀器和試劑

1.2.2.1 實驗儀器 SLAN-96S全自動定量PCR儀（上海宏石醫療科技有限公司），Lab-Aid824s全自動DNA提取儀（廈門致善生物科技股份有限公司），HB-2012A醫用核酸分子雜交儀（廣州凱普醫藥生物科技有限公司），2081Panthera-PuncherTM9型打孔儀（芬蘭鉑金埃爾默有限公司），721G分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2.2.2 實驗試劑 （1）地貧基因檢測試劑：熔解曲線法α地貧試劑盒、非缺失α地貧試劑盒、β地貧基因試劑盒及Lab-Aid824s核酸提取Micro試劑盒（廈門致善生物科技股份有限公司）。（2）地貧基因驗證試劑：血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）和α、β地貧基因檢測試劑盒（PCR+導流雜交法）（廣州凱普醫藥生物科技有限公司），α地貧試劑盒（PCR法）、非缺失α地貧和β地貧基因試劑盒（PCR+反向雜交法）（深圳亞能生物技術有限公司）。

1.2.3 基因檢測方法

1.2.3.1 基因檢測實驗 打孔儀打下6～8個直徑3 mm的干血斑置于離心管中，使用磁珠法提取干血斑DNA，然后使用熔解曲線法對所提取到的DNA進行檢測，檢測范圍涵蓋試劑盒所能檢出的地貧基因型。

1.2.3.2 基因驗證實驗 再次使用打孔儀打下6～8個直徑3 mm的干血斑置于離心管中，柱狀法提取DNA，然后使用凱普地貧基因試劑盒和亞能基因試劑盒進行地貧基因驗證。

1.2.3.3 新基因型驗證 熔解曲線法地貧基因試劑盒提示的未知突變樣本外送基因公司進行基因型分析。

1.2.3.4 結果判讀 嚴格按照每種地貧基因試劑盒說明書進行標準化判讀。

1.3 質量控制 （1）干血斑樣本驗收：合格的干血斑要雙面滲透均勻，不能受到化學制劑的污染，不能風干或曬干。信息記錄完整，血斑不能有血凝塊。（2）提取DNA濃度純度驗證：依據試劑說明書，DNA樣本的OD260nm/OD280nm應在1.6～2.0。（3）實驗操作：每個步驟嚴格按照試劑說明書和設備使用程序進行，每批實驗各設立陰性對照和陽性對照。

1.4 觀察指標 出生人數、篩查人數、檢出地貧人數、篩查率、檢出率。

1.5 統計學方法 采用 SPSS 13.0統計軟件對數據進行描述。計數資料以相對數表示。

2 結果

2.1 海南省白沙縣2020年新生兒地貧基因篩查基本情況白沙縣2020年地貧基因篩查率為97.9%；共檢出地貧基因異常608例，海南省白沙縣地貧基因攜帶率為66.7%。在340例漢族檢測人群中檢出地貧175例，漢族地貧基因攜帶率為51.5%；在540例黎族檢測人群中檢出地貧414例，黎族地貧基因攜帶率高達76.7%；在32例其他少數民族檢測人群中檢出地貧19例，其他少數民族地貧基因攜帶率為59.4%，不同民族地貧基因篩查情況詳見表1。

表1 海南省白沙縣2020年新生兒地中海貧血基因篩查情況Table 1 Basic situation of neonatal thalassemia gene screening in Baisha County，Hainan Province in 2020

2.2 海南省白沙縣新生兒地貧基因類型及檢出率 本次針對地貧基因的篩查中，共檢出試劑盒中包含的34種類型，其中α地貧基因型為最多，共檢出521例；其次是α地貧復合β地貧基因型，共檢出62例；β地貧基因型最少，共檢出 25例。其中-α3.7/αα、-α4.2/αα 和 αWSα/αα 基因型排在所有檢出基因型的前三位，分別占26.3%、23.8%和12.7%，并檢出-α4.2/HKαα、c.118C>T和c.309C>T三種少見地貧基因型。詳見表2～4。

表2 海南省白沙縣新生兒α地貧基因型及檢出率Table 2 Genetic types and detection rates of neonatal α thalassemia in Baisha County，Hainan Province

表3 海南省白沙縣新生兒β地貧基因型及檢出率Table 3 Gene types and detection rate of βthalassemia in newborn population of Baisha County，Hainan Province

表4 海南省白沙縣新生兒α地貧復合β地貧基因型及檢出率Table 4 Genetic types and detection rates of α thalassemia combined with β thalassemia in newborn population of Baisha County，Hainan Province

3 討論

有研究數據表明，全世界每年有超過33萬的新生兒血紅蛋白異常，其中就有17%是地貧患兒[6]。而且地貧癥狀一般隱匿性強，患兒出生3～6個月才逐漸出現嚴重貧血的典型地貧癥狀，并常伴有發育遲緩、骨骼異常等癥狀，嚴重者甚至可能出現心力衰竭等并發癥，重型患者如不盡早進行干預治療，多于5歲前死亡[7]。海南省已見地貧相關的多篇成人文獻[3-5]，但還未見針對新生兒群體的地貧報道。

2020 年白沙縣內各助產單位活產新生兒932例，因部分家長拒絕參與篩檢，實際收集到樣本912例，篩查率達97.9%（912/932），因此受檢人群能代表全體白沙縣新生兒人群。本次篩查共檢出608例地貧基因異常新生兒，海南省白沙縣地貧基因攜帶率高達66.7%，分析原因可能與民族構成有關，本次篩查樣本中黎族540例，而漢族僅為340例，黎族比例高，黎族地貧基因高攜帶率[9]已是不爭事實，白沙縣地處海南省中部山區，交通極為不便，外輸人口少，推測民族之間通婚發生了基因融合，導致了該地區新生兒地貧基因的高攜帶率。目前國內尚未有文章報道如此高的地貧基因攜帶率。因此本研究抽取前81例樣本采用凱普基因試劑盒驗證，抽取中間35例樣本使用亞能地貧基因試劑盒進行驗證，結果與熔解曲線法檢測的地貧結果完全一致。這證明海南省白沙縣新生兒群體地貧基因攜帶率確實高，需要引起有關部門的注意，白沙縣并非海南省唯一少數民族自治縣，黎族地貧基因高攜帶率已被認知，大量的黎族同胞聚居昌江、樂東、瓊中等七個少數民族市縣的情況下，建議海南省政府應在白沙縣等少數民族聚居地進行新生兒地貧基因篩查，以提高少數民族地區出生人口素質和生活質量、降低新生兒的死亡率。

本研究中白沙縣黎族新生兒人群地貧基因攜帶率最高，達76.7%，高于漢族的51.5%和其他少數民族的59.4%，這驗證了“黎族是地貧基因攜帶率高的民族”的結論[9]。

海南省白沙縣地貧基因型豐富，本次共檢出34種基因型，地貧基因型分類以α地貧基因型為主，這符合地貧在中國南方的分布特征[10-11]，而不同于重慶地區以β地貧基因型為主的狀況[12]。白沙縣α地貧基因型以-α3.7/αα、-α4.2/αα和αWSα/αα最常見，這與海南陵水縣[13]具有相似之處，可能原因為陵水縣和白沙縣均屬于黎族自治縣，但因為黎族人口所占比例不同而略有區別。白沙縣β地貧基因型以βCD41-D42/βN多見，這與四川地區[14]一致，而與貴州[15]有別，進一步驗證了地貧基因分布存在地域特征[16-17]。在發現的3種少見基因型中有2例少見基因型c.309C>T，這是試劑盒未涵蓋的位點，經熔解曲線圖外送基因測序得到了證實，該突變是一種錯義突變，目前還無文獻報道。其余兩種少見基因型已有報道[18]。

鑒于海南省是地貧的高發地區，海南省政府特別重視地貧防控，從2012年開始便將地貧納入婚檢項目，在婚檢和孕檢人群中開展地貧篩查，建立地貧防控工作與免費婚檢工作相結合的新機制。雖然兒童地貧患病率有減低趨勢[19]，但有報道稱海南省海口市和三亞市新生兒人群中地貧發生率仍高達5%[20]和7.85%[19]，地貧患兒的營養和發育狀況更差[21]，因此在婚檢和孕檢中進行地貧防控的前期，應該在新生兒人群進行地貧基因篩檢，這將是對地貧防控網絡的必要而有益補充。

對于新生兒群體來講，傳統的血常規、電泳及基因檢測聯合篩查地貧方式存在著諸多不利因素，因此借助新生兒疾病篩查濾紙干血斑進行地貧基因檢測，不用重復采血，有利于群體性篩查，而且該方法也得到了臨床驗證[22-23]。

總之，海南省白沙縣新生兒人群中地貧基因攜帶率高，以α 地貧基因型最為常見。本研究對白沙地區地貧篩檢提供了參考，也為政府決策部門制定地貧防控策略提供了有力的數據支持。

本研究局限性：

（1）只統計了白沙縣新生兒地貧基因的高攜帶率，但限于目前對于地貧的認知水平和隨訪中存在著家長配合度等各種困難，并未在此論述地貧基因型與表型的關系；在臨床表型中，輕型和靜止型患者與常人無異，因此并未對此加以詳述，但此研究證明了白沙縣新生兒地貧的高攜帶率，這為政府決策部分地貧防控提供了方向；（2）本研究使用的基因試劑盒涵蓋的位點雖然較多，未檢出地貧樣本也不一定未攜帶地貧基因，也可能為其他罕見型，這需要不斷隨訪來證實；（3）地貧熔解曲線方法只是篩選核酸序列而不是氨基酸序列，但鑒于地貧的復雜性，仍有可能發生多態性或同義突變被判讀為突變型的情況。

作者貢獻：石海杰負責文章的構思與設計、文獻檢索與數據提取和統計分析、論文撰寫；趙振東負責文章的構思與設計、研究實施、數據資料收集和分析、論文的修訂和審校，對文章整體負責。

本文無利益沖突。