益腎養髓方對脊髓型頸椎病大鼠脊髓中神經營養因子表達的影響及其神經修復作用研究

唐彬，銀河，楊博文，金哲峰，秦曉寬，劉志偉，魏戌，孫凱，齊寶玉，陳忻*，朱立國，3*

脊髓型頸椎病（cervical spondylotic myelopathy，CSM）是由于椎間盤突出、韌帶骨化、頸椎失穩或畸形、生物力學改變等導致脊髓受壓或缺血損傷，進而引起的脊髓傳導功能障礙性疾病[1]。近年來其發病率逐年升高，發病年齡趨于年輕化，成為嚴重危害中老年乃至青年人健康的常見頸椎疾患之一[2]。手術療法能夠有效解除脊髓的壓迫，并同時改善脊柱的穩定性，是臨床上治療CSM的重要手段。但對于不能耐受手術、輕度或癥狀不明顯的中度CSM患者，非手術療法仍然是必要的。

前期臨床研究已證實益腎養髓方用于治療病情平穩、手術指征不明顯的早中期CSM患者已獲得比較滿意的臨床療效，且其可緩解CSM患者術后臨床癥狀[3]。在臨床證據較為充分的前提下，益腎養髓方的藥效研究及其對神經元保護作用的基礎研究，對于闡明其療效機制和促進中醫藥的現代化具有非常重要的意義。

本研究采用國際公認的吸水膨脹材料壓迫脊髓的方法建立CSM動物模型，前期相關基礎研究已證實該造模方法的穩定性較好并得到了研究者的認可[4]。本研究通過觀察造模后大鼠運動功能指數評分（Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale，BBB評分）記錄大鼠四肢運動功能情況，采用尼氏體焦油染色、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）法和免疫組織化學等技術檢測受壓節段脊髓神經細胞功能形態、脊髓組織中相關mRNA、蛋白表達分布情況，旨在從分子水平探討益腎養髓方對慢性脊髓壓迫后受損脊髓神經修復的干預作用，以期闡明該藥治療CSM的療效，為下一步深入研究作用機制奠定基礎，并為益腎養髓方的臨床應用提供實驗理論依據。

本研究創新點：

本研究采用吸水膨脹凝膠材料，能夠更真實地模擬脊髓型頸椎病患者脊髓慢性受壓的病理過程。隨后在不同時間點對神經元修復情況進行研究，發現脊髓慢性受壓后可能存在一定自我修復，中醫藥治療早期能明顯提高脊髓中神經營養相關因子的表達，促進脊髓神經元修復，這提示對該病早期治療的重要性，也為中醫藥治療開啟了新思路。

待研究的問題：

中醫藥治療是如何提高神經營養相關因子表達，及相關因子如何調控下游分子，最終促進脊髓神經元修復的機制有待后續研究探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 于2019年1月選取SPF級雌性SD大鼠96只，240～250 g/只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2017-0033。大鼠飼養于中國食品藥品檢定研究院，適應性飼養3 d，室溫25 ℃左右，光照時間為8：00～20：00。本研究經中國食品藥品檢定研究院倫理委員會批準，嚴格遵守中國食品藥品檢定研究院實驗動物保護和使用規定。

1.2 試劑與儀器 0.9%氯化鈉注射液、乙醇、碘伏、青霉素，純凈水、PBS、4%多聚甲醛溶液、2%水合氯醛；尼氏染色液（焦油紫法，Solarbio，貨號：G1430），Trizol（Invitrogen，貨號：15596018），通用反轉錄試劑盒M-MLV（Solarbio，貨號：RP1100），SYBR Green PCR Mix（Solarbio，貨號：SR1110），NGF多克隆抗體（Solarbio，貨號：K001636P）、中性樹膠（Solarbio，貨號：G8590）、檸檬酸鈉抗原修復液（Solarbio，貨號：C1031）、蘇木素染色液（Solarbio，貨號：G1080）；引物由北京索萊寶科技有限公司設計，由擎科生物合成；刀柄、眼科剪、線剪、有齒鑷、無齒鑷、持針器、彎鉗、直鉗、單關節骨剪，購于上海醫療器械（集團）有限公司；不銹鋼高壓鍋、電磁爐、濕盒/孵育盒、電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司，型號：KH-5000E）、電子天平（Mettler公司，AE160型）、離心機（Eppendorf，型號：5427R）、PCR儀（Thermo，型號：4375786）、組織脫水機（德國Leica公司，型號：ASP200S）、組織包埋機（德國Leica公司，型號：EG1150C）、石蠟切片機（德國Leica公司，型號：RM2245）等；5 ml注射器、三角縫合針、2-0醫用真絲縫合線、刀片、醫用紗布、棉球。

1.3 中藥制備 益腎養髓方藥物組成：巴戟天9 g、熟地黃12 g、鹿角霜12 g、白芍12 g、黃芪15 g、桂枝6 g、丹參9 g、鬼箭羽12 g、羌活6 g，購自中國中醫科學院望京醫院藥劑科，中藥煎煮后水浴濃縮，用純凈水對濃縮后的藥液進行等比稀釋，冷藏備用，水煎煮和濃縮程序按照《中國藥典》2010版規定執行。大鼠灌胃給藥劑量，采用體表面積系數換算，以成人 70 kg，大鼠200 g，換算系數6.3計算[5]，高濃度為16.74 g·kg-1·d-1、中濃度為 8.37 g·kg-1·d-1、低濃度為 4.19 g·kg-1·d-1。

1.4 CSM模型建立 采用吸水膨脹材料聚乙烯醇丙烯酰胺互穿網絡水凝膠（由北京師范大學化學學院提供）壓迫脊髓的方法進行造模[4]。術前采用BBB評分評估大鼠后肢運動功能（正常大鼠為滿分21分）。造模：取72只大鼠用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，剃除大鼠頸后部皮毛，常規碘伏消毒、鋪巾，大鼠頸椎后正中做一3～4 cm切口，暴露頸肩部肌群，找到第2胸椎棘突，自下往上正中切開肌肉群向兩側牽開，沿棘突兩側剝離棘突上附著肌肉，找到并暴露整個C5～7頸椎骨椎板，剔除C7和T1椎板間黃韌帶和部分椎板，從椎板間隙小心將吸水膨脹材料（1.5 mm×0.7 mm×0.3 mm）植入C5～7椎板下，操作要輕柔以防止腦脊液漏出、脊髓損傷。逐層縫合肌肉、皮膚，肌肉注射青霉素8萬U/只，術畢。術后2周評價大鼠BBB評分[6]，8～14分為造模成功，隨機分組以保證灌胃前每組CSM模型大鼠脊髓損傷程度的一致性。

假手術：取24只大鼠采用上述方法暴露C5～7椎板，剔除C7和T1椎板間黃韌帶和部分椎板，小心將同體積吸水膨脹材料植入C5～7椎板下后隨即取出，不造成脊髓壓迫。

術后將大鼠放入鼠籠，于25 ℃左右室溫喂養。每日早晚人工擠壓膀胱協助排尿，至形成反射性排尿為止，如有死亡及時補充。

1.5 分組 假手術大鼠作為假手術組（n=24），造模成功的大鼠隨機分為模型組（n=24）、中藥高濃度組（n=16）、中藥中濃度組（n=16）、中藥低濃度組（n=16）。中藥灌胃的各組按照對應濃度進行灌胃，藥液濃縮后以1 ml/100 g體積灌胃給藥，模型組及假手術組灌服等量（1 ml/100 g）0.9%氯化鈉注射液，1次/d。分別于術后4、6、8、10周，評價各組大鼠BBB評分。

1.6 脊髓樣本取材 第一次取材于術后2周從假手術組和模型組中每組隨機選取8只大鼠，第二次取材于術后6周從5組中每組隨機選取8只大鼠，第三次取材于術后10周從5組中每組隨機選取8只大鼠。

每個時間點每組隨機選取的8只大鼠中，有4只大鼠采用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射進行麻醉，手術剪打開大鼠胸腔，暴露心臟，于左心室靠近心尖搏動處插入灌流針頭，注入0.9%氯化鈉溶液250 ml，直到肝臟和肺臟顏色轉白及右心房流出液體澄清，再使用4%多聚甲醛溶液進行灌注，大鼠出現四肢抽搐、四肢及尾巴僵硬和全身強直現象時停止灌流。取C5～7對應脊髓節段，固定、脫水、透明、石蠟包埋，冠狀切片厚約3 mm，用于尼氏染色和免疫組織化學法檢測。

每組隨機選取的另外4只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg），處死，取C5～7對應脊髓節段到凍存管后，放置于液氮速凍，隨后轉入-80 ℃冰箱保存，用于RT-qPCR檢測。

1.7 尼氏染色 用二甲苯常規脫蠟15 min，然后梯度乙醇脫水5 min，蒸餾水沖洗3次，5 min/次，然后置于60 ℃溫箱用焦油紫染色10 min，蒸餾水洗凈染料后，分別置于梯度乙醇中脫水，再用二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。利用數字掃描儀進行掃描，adimec Q-12A-180Fc相機拍照，用CaseViewer 2.4軟件放大400倍觀察脊髓前角神經元形態，并計算視野下尼氏染色陽性的正常脊髓前角神經元數量。1.8 RT-qPCR 采用RT-qPCR檢測各組大鼠脊髓中神經生長因子（nerve growth factor，NGF）、神經營養因子3（neurotrophin-3，NT3）和膠質細胞源性神經營養因子（glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF），以β-actin為內參基因，引物序列信息見表1，將引物離心（轉速13 000 rpm，5 min），根據標示量，加入滅菌水至終濃度10 μmol/L，溶解后分裝，-20 ℃以下保存備用。組織總RNA提取后，在260/280 nm下測定純度和濃度（A260/A280=1.8-2.0）；核酸電泳檢測RNA完整性（28 s、18 s）。根據通用反轉錄試劑盒M-MLV合成互補DNA。熒光染料采用SYBR Green PCR Mix。配制總反應體系25 μl。反應條件：95 ℃預變性10 min，1個循環；95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共45個循環。每個指標/樣本均做3個技術重復，要求3個重復產生的Ct值偏差不超過0.5。當樣本Ct值的偏差超過0.5時，可將明顯偏離的孔扣除后計算；當3個孔Ct值的偏差均超過1.0，樣本數據不采用。空白孔Ct值要大于35，當Ct值偏小時，數據不采用。樣本擴增后的溶解曲線應只有一個峰。Roche lightcycler 480輸出原始數據，導出文件。采用2-ΔΔCt計算樣本各指標mRNA表達水平。

表1 目的基因及內參基因的引物序列Table 1 Primer sequence of target gene and internal reference gene

1.9 免疫組織化學法檢測NGF 脊髓前角區蛋白表達及分布情況取大鼠脊髓切片，脫蠟，脫苯，入水，抗原高壓修復，孵育，加30 μl NGF一抗，37 ℃孵育90 min，清洗，加二抗，37 ℃孵育30 min，清洗，加DAB顯色劑后，在顯微鏡下控制染色深淺，水洗，襯染，藍化，脫水，透明，封片。利用數字掃描儀進行掃描，adimec Q-12A-180Fc相機拍照，用CaseViewer 2.4軟件放大400倍觀察脊髓前角區域。使用IPP 6.0圖像分析軟件對圖像進行分析，測定組織中顯示棕色的陽性細胞數，計算平均吸光度值。每個樣本分別統計5個視野，結果取均值。

1.10 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行數據分析。正態性檢驗采用Shapiro-Wilk檢驗，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用Tukey法[7-8]。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BBB評分 術后2周，即灌胃前，5組BBB評分比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其中假手術組BBB評分高于模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05）；模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組之間的BBB評分兩兩比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。術后4周，即灌胃2周后，5組BBB評分比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其中假手術組BBB評分高于模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05）；模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組之間的BBB評分兩兩比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。術后6周，即灌胃4周后，5組BBB評分比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其中假手術組BBB評分高于模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05）；模型組BBB評分低于中藥高濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組分別與中藥中、低濃度組BBB評分比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；中藥高濃度組BBB評分高于中藥中、低濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05）；中藥中濃度組與中藥低濃度組BBB評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。術后8周，即灌胃6周后，5組BBB評分比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其中假手術組BBB評分高于模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05）；模型組BBB評分低于中藥高濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組分別與中藥中、低濃度組BBB評分比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；中藥高濃度組BBB評分高于中藥中、低濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05）；中藥中濃度組與中藥低濃度組BBB評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。術后10周，即灌胃8周后，5組BBB評分比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其中假手術組BBB評分高于模型組、中藥高濃度組、中藥中濃度組和中藥低濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05）；模型組BBB評分低于中藥高、中濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05）；模型組與中藥低濃度組BBB評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）；中藥高濃度組BBB評分高于中藥中、低濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05）；中藥中濃度組與中藥低濃度組BBB評分比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

表2 五組大鼠肢體運動功能指數評分比較（±s，分）Table 2 Comparison of Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale scores of motor function of the five groups of rats

表2 五組大鼠肢體運動功能指數評分比較（±s，分）Table 2 Comparison of Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale scores of motor function of the five groups of rats

注：a表示與假手術組比較，P<0.05；b表示與模型組比較，P<0.05；c表示與中藥高濃度組比較，P<0.05

組別 術前 術后2周 術后4周 術后6周 術后8周 術后10周假手術組 21.00±0.00（n=24） 20.07±0.00（n=24） 21.00±0.00（n=16） 21.00±0.00（n=16） 21.00±0.00（n=8） 21.00±0.00（n=8）a模型組 21.00±0.00（n=24） 10.78±1.43（n=24）a 11.05±4.52（n=16）a 12.33±1.42（n=16）a 13.46±1.66（n=8）a 15.52±1.05（n=8）a中藥高濃度組 21.00±0.00（n=16） 10.21±1.72（n=16）a 12.25±1.78（n=16）a 15.15±1.36（n=16）ab 17.62±1.49（n=8）ab 19.33±1.18（n=8）ab中藥中濃度組 21.00±0.00（n=16） 10.57±1.64（n=16）a 11.94±1.52（n=16）a 13.51±1.25（n=16）ac 15.25±1.64（n=8）ac 17.46±1.23（n=8）abc中藥低濃度組 21.00±0.00（n=16） 10.39±1.67（n=16）a 11.68±1.15（n=16）a 13.39±1.46（n=16）ac 14.34±1.39（n=8）ac 16.90±1.35（n=8）ac F值 216.40 152.60 122.60 38.38 31.58 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

2.2 尼氏染色 染色切片中可見顆粒狀的小神經元和斑塊狀脊髓運動神經元中的尼氏體嗜堿性物質被染成淺紫色，散在均勻分布于核周細胞質及樹突內，而軸突內缺失。脊髓前角中正常運動神經元胞體較大且成多邊形，尼氏體數目較多，代謝合成旺盛，通過尼氏染色可清晰反映其數量和細胞功能。術后2周，即灌胃前，假手術組脊髓前角運動神經元形態正常，無損傷，可見大量虎斑狀尼氏體，豐富飽滿；模型組脊髓前角神經元細小，細胞形態由多極形狀變為圓形，分布稀疏，并形成較多空洞，細胞內尼氏體溶解減少甚至消失；在術后6周、10周時，中藥高、中濃度組脊髓前角神經元雖有一定程度損傷，但細胞形態豐滿、可見細胞內虎斑狀尼氏體；中藥低濃度組脊髓前角可見少量空泡，神經元細胞分布略稀疏，單個細胞內尼氏體數目比中藥高、中濃度組含量少，見圖1。

圖1 不同時間點各組大鼠脊髓前角尼氏染色（×400，n=4）Figure 1 Nissl's staining results of anterior horn of spinal cord in rats at different time points

術后2周，假手術組正常神經元數目多于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。術后6周，5組正常神經元數目比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其中假手術組正常神經元數目多于模型組、中藥中濃度組和中藥低濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）；假手術組正常神經元數目與中藥高濃度組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；模型組正常神經元數目少于中藥高濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組正常神經元數目分別與中藥中、低濃度組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；中藥高濃度組正常神經元數目多于中藥低濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05）；中藥高濃度組正常神經元數目與中藥低濃度組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；中藥中濃度組正常神經元數目與中藥低濃度組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。術后10周，5組正常神經元數目比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其中假手術組正常神經元數目多于模型組、中藥低濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）；假手術組正常神經元數目與中藥高、中濃度組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；模型組正常神經元數目少于中藥高濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）；模型組正常神經元數目分別與中藥中、低濃度組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；中藥高濃度組正常神經元數目與中藥中、低濃度組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；中藥中濃度組正常神經元數目與中藥低濃度組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

表3 五組大鼠脊髓前角神經元數目比較（±s，n=4）Table 3 The number of healthy neurons positive for Nissl's stain in the anterior horn of the spinalcord of the five groups of rats

表3 五組大鼠脊髓前角神經元數目比較（±s，n=4）Table 3 The number of healthy neurons positive for Nissl's stain in the anterior horn of the spinalcord of the five groups of rats

注：a表示與假手術組比較，P<0.05；b表示與模型組比較，P<0.05；c表示與中藥高濃度組比較，P<0.05；d表示t值；-表示無相關數據

組別 術后2周 術后6周 術后10周假手術組 16.50±2.27 15.00±1.65 16.25±2.10模型組 8.75±2.59a 9.00±2.24a 10.25±1.37a中藥高濃度組 - 13.75±1.89b 14.51±2.17b中藥中濃度組 - 11.00±2.66a 12.75±2.03中藥低濃度組 - 10.00±1.55ac 10.75±1.79a F（t）值 4.501d 6.193 6.954 P值 0.004 0.004 0.002

2.3 RT-qPCR結果 術后2周，即灌胃前，假手術組與模型組的NGF、NT3、GDNF的mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。術后6周，5組NGF mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）；中藥高濃度組NGF mRNA表達水平高于假手術組、模型組和中藥低濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05），其他組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。5組NT3 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）；中藥高濃度組NT3 mRNA表達水平高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），其他組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。5組GDNF mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）；中藥高濃度組GDNF mRNA表達水平高于假手術組、模型組和中藥中、低濃度組，差異均有統計學意義（P<0.05），其他組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。術后10周，5組NGF、NT3、GDNF的mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表4。

表4 五組大鼠NGF、NT3、GDNF的mRNA表達水平比較（±s，n=4）Table 4 Comparison of mRNA of NGF，NT3 and GDNF of the five groups of rats

表4 五組大鼠NGF、NT3、GDNF的mRNA表達水平比較（±s，n=4）Table 4 Comparison of mRNA of NGF，NT3 and GDNF of the five groups of rats

注：a表示與假手術組比較，P<0.05；b表示與模型組比較，P<0.05；c表示與中藥高濃度組比較，P<0.05；d表示t值；-表示無相關數據

組別 NGF mRNA NT3 mRNA GDNF mRNA術后2周 術后6周 術后10周 術后2周 術后6周 術后10周 術后2周 術后6周 術后10周假手術組 1.00±0.15 0.94±0.15 0.88±0.28 1.00±0.18 1.01±0.12 0.68±0.18 1.00±0.17 0.60±0.05 0.36±0.17模型組 0.96±0.23 3.75±1.12 1.04±0.14 1.01±0.30 0.93±0.14 0.83±0.26 1.06±0.59 2.42±0.24 0.68±0.59中藥高濃度組 - 5.38±1.83ab 1.20±0.39 - 1.36±0.09b 0.83±0.08 - 6.32±2.89ab 0.51±0.17中藥中濃度組 - 2.59±0.79 0.84±0.23 - 1.17±0.21 0.64±0.18 - 2.09±0.66c 0.31±0.13中藥低濃度組 - 2.42±0.74c 1.13±0.24 - 1.11±0.10 0.58±0.07 - 1.41±0.55c 0.78±0.79 F（t）值 0.272d 7.274 1.231 0.052d 4.196 1.550 0.164d 8.021 0.649 P值 0.797 0.005 0.349 0.961 0.030 0.250 0.876 0.004 0.639

2.4 免疫組織化學結果 術后2、6、10周的假手術組和模型組中脊髓前角神經元NGF染色程度較淺，呈彌漫性稀疏分布；中藥高、中濃度組大鼠的脊髓前角神經元NGF染色較明顯，細胞形態完整，見圖2。大鼠術后2周時，即灌胃前，假手術組與模型組的大鼠脊髓前角神經元NGF平均積分光密度值比較，差異無統計學意義（P>0.05）。術后6周，5組NGF平均積分光密度值比較，差異有統計學意義（P<0.05）；中藥高濃度組NGF平均積分光密度值高于假手術組和模型組，差異均有統計學意義（P<0.05），其他組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。術后第10周，5組NGF平均積分光密度值比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表5。

圖2 不同時間點各組大鼠脊髓前角NGF免疫組織化學染色結果（×400，n=4）Figure 2 Immunohistochemistry results of NGF in the anterior horn of spinal cord of rats at different time points

表5 五組大鼠NGF平均積分光密度值比較（±s，n=4）Table 5 Comparison of mean integrated optical density of NGF of the five groups of rats

表5 五組大鼠NGF平均積分光密度值比較（±s，n=4）Table 5 Comparison of mean integrated optical density of NGF of the five groups of rats

注：a表示與假手術組比較，P<0.05；b表示與模型組比較，P<0.05；c表示t值；-表示無相關數據

組別 術后2周 術后6周 術后10周假手術組 0.23±0.09 0.19±0.05 0.18±0.08模型組 0.25±0.13 0.31±0.07 0.23±0.06中藥高濃度組 - 0.51±0.11ab 0.30±0.09中藥中濃度組 - 0.35±0.09 0.24±0.10中藥低濃度組 - 0.25±0.07 0.21±0.12 F（t）值 0.253c 9.058 0.927 P值 0.809 0.001 0.474

3 討論

結合古籍及現代醫家對CSM的認識，該病當從“痹證”和“痿證”辨證論治[9]，根本病機是本虛標實，肝腎不足、氣血虧虛為本，外邪侵襲、經絡不通、風寒濕邪客居于經脈為標[10-12]。益腎養髓方由巴戟天、熟地、丹參、鬼箭羽等9味藥物組成，其中巴戟天補腎溫陽、強筋壯骨，熟地補血滋陰、益精填髓，二者合而為君；丹參、鬼箭羽等活血通經、通絡止痛、暢督脈經氣，使藥力達于頸部。從CSM“本虛標痹”的病機出發，共奏補肝益腎、活血通經之效。

本研究動物行為學評價結果顯示，益腎養髓方能較好的改善大鼠四肢運動功能，增加步態動作協調性，在灌胃4周時療效開始顯現，在灌胃8周后效果更為明顯，且中藥高濃度組的改善效果最為顯著。尼氏體由粗面內質網和游離核糖體組成，其功能是合成更新細胞器所需的結構蛋白、合成神經遞質所需的酶類以及肽類的神經調質。代謝功能旺盛的神經元中尼氏體特別豐富，當神經元受到損傷或過度疲勞時，尼氏體可減少、解體甚至消失。在損傷或疲勞恢復過程中，尼氏體又重新出現、增多，并可至正常水平，故尼氏體可作為神經元功能狀態的標志[13-15]。本研究尼氏焦油紫染色結果顯示，中藥高、中濃度組可以有效增加脊髓前角正常神經元的數量，同時提高神經元細胞內尼氏體數量，提示中藥能增強細胞代謝和蛋白質合成的能力，與動物行為學結果一致。動物行為學和尼氏焦油紫染色結果均提示高、中濃度的益腎養髓方能起到保護脊髓前角運動神經元細胞、改善運動功能的作用。

NGF、NT3、GDNF是促進脊髓修復較為經典的神經營養因子，中藥增加神經元數量可能與促進神經營養因子的分泌有關。NGF是神經營養因子中目前研究最明確的分子之一，當神經元受到機械刺激、缺血缺氧時，NGF增加并作用于含有相關受體的神經元細胞，使脊髓損傷后的神經再生、組織重塑和功能恢復[16]，對于延緩神經退行性病變，或者刺激脊髓損傷患者運動神經的生長，其效果尤為顯著，已有研究證實NGF是治療受損中樞神經系統神經再生的有效藥物[17]。NT3與NGF的氨基酸序列類似，其能作用于皮質脊髓束，促進細胞軸突生長，提高運動行走的能力，且不會刺激感覺神經元產生疼痛相關反應[18-20]。GDNF是很強的膽堿能運動神經營養因子，其能促進神經元的軸突生長，減少神經元凋亡。在用損傷誘導的脊髓運動神經元退變模型中，用GDNF治療可防止50%神經元的丟失，且使運動神經元體積增大，起到支持神經元存活的作用[21-23]。眾多研究報道中藥復方或中藥單體可以提高NGF、NT3、GDNF水平，達到促進脊髓神經修復的作用[24-28]。本研究RT-qPCR和免疫組織化學結果顯示，造模后第2周到第10周，模型組、假手術組NGF的mRNA表達處于較低水平，其中第4周模型組比假手術組水平稍高，但不顯著。在益腎養髓方灌胃4周時，中藥高濃度組能顯著提高脊髓中NGF的mRNA表達水平，同時也能促進的NGF蛋白表達增加，特別是脊髓前角中大神經元更為顯著。但在灌胃8周時，NGF的mRNA表達又回落到較低水平，NT3和GDNF的mRNA表達情況也與NGF類似。這提示大鼠自身針對外界的機械損傷有一定程度的自我修復作用，但并不明顯，中藥干預后能顯著增加神經元的自我修復功能，刺激神經元生長，進而緩解慢性壓迫脊髓造成的病變；在中藥干預后期，中藥組NGF、NT3、GDNF的mRNA表達降低，并與假手術組趨于一致，這可能是脊髓內的修復過程基本完成，大鼠運動功能和神經元細胞的數量和形態已有較大改善，故脊髓中相關神經營養因子的需求和合成有所降低，也間接提示脊髓型頸椎病早期治療干預的意義較大。

綜上所述，益腎養髓方可明顯改善CSM模型大鼠的四肢運動功能，增加脊髓前角中正常功能運動神經元的數量。同時顯著增加脊髓中NGF、NT3、GDNF的mRNA表達水平，以及脊髓前角神經元中NGF的蛋白表達水平，進而達到促進神經修復的作用。

作者貢獻：陳忻、朱立國進行研究思路設計并對文章負責；唐彬進行研究實施、資料收集整理、撰寫論文；銀河進行研究的質量控制及審校；楊博文、金哲峰、秦曉寬、劉志偉、魏戌、孫凱、齊寶玉參與動物實驗實施評估、技術操作和資料收集。

本文無利益沖突。