基于二階校正方法的牛乳中沙門氏菌快速檢測

陳 煜，邱智軍，張 彬

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽 471003）

牛奶及其制品中含有豐富的營養物質，包括人體生長發育所需的各種必需氨基酸、非必需氨基酸、礦物質和維生素等，是目前普遍受消費者歡迎的滋補飲品[1-2]。但其在生產、加工及運輸過程中易受到食源性病原微生物的污染，進入人體之后會引發一系列身體不適，嚴重威脅人體健康[3]。常見食源性致病菌有沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌等，一般通過攝食感染人體并在體內大量繁殖進而使人患上感染性疾病或者中毒性疾病[4-5]。而沙門氏菌是一種可以引發食物中毒的重要食源性病原菌，也是人畜共患病之一[6]，被感染者會引起食物中毒、胃腸炎、腹瀉等疾病，且目前出現越來越多的耐藥性現象，因此建立牛奶中沙門氏菌殘留快速、高效檢測方法尤為重要。

目前，關于沙門氏菌傳統的檢測方法主要有生物化學法，通過細菌培養，檢測其在培養基中的代謝產物，通過判斷細菌的分解代謝特征，進而達到細菌檢測的目的，該方法成本低、準確度高，檢測結果比較直觀，且能夠得到定性和定量的分析與結果，但檢測周期較長，且操作比較繁瑣，不能滿足現場實時快速檢測[7]。近年來，隨著檢測技術的革新，一些新的檢測技術逐漸被開發出來，三維熒光檢測技術以其靈敏度高、在線檢測時間短、樣品前處理簡單等優點而被用于各種微生物的快速鑒別和表征[8-9]。三維熒光光譜儀的結構主要包括光源、激發單色器、樣品池、發射單色器和檢測器等。首先光源發出光經過激發單色器得到想要的激發波長，激發樣品產生熒光，然后熒光經過發射單色器被檢測器收集并變成相應的電信號，最后以光譜形式呈現出來[10]。

三維熒光光譜儀器見圖1。

圖1 三維熒光光譜儀器

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑

無菌牛奶，購自洛陽家樂福超市；LB液體培養基（胰蛋白胨2 g、酵母粉1 g、NaCl 2 g溶于200 mL蒸餾水，并采用高壓蒸汽滅菌）；LB固體培養基（胰蛋白胨6 g、酵母粉3 g、NaCl 6 g、瓊脂12 g溶于1 000 mL蒸餾水，并高壓蒸汽滅菌）；生理鹽水（NaCl 0.9 g溶于1 000 mL蒸餾水，并采用高壓蒸汽滅菌）。

1.1.2 儀器及設備

ME204E型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產品；QE-3型臺式恒溫振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司產品；HYL-G型恒溫振蕩搖床，江蘇太倉市強樂實驗設備有限公司產品；Cary Eclipse型三維熒光光譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化及擴大培養[11]

使用滅菌的接種環挑取少量菌種接入含有50 mL的LB液體培養基的錐形瓶中，于37℃下以轉速150 r/min振蕩培養24 h，該步驟為菌種活化。用移液槍吸取50μL活化好的第一代菌懸液于含有50 mL的LB液體培養基的錐形瓶中，于37℃下以轉速150 r/min振蕩培養12 h，此步驟為菌種的擴大培養。

1.2.2 菌懸液的制備[12]

取第二代菌懸液4 mL于10 mL離心管中，25℃條件下，以轉速5 000 r/min離心10 min，去除上清液，向沉淀中加4 mL生理鹽水充分振蕩，以轉速5 000 r/min離心10 min，再次去除上清液并入加5 mL生理鹽水懸浮混勻，制成菌懸液。

1.2.3 校正樣和測試樣確定

取1 mL離心后的菌懸液于含有9 mL牛奶的試管中，振蕩搖晃使之混勻，制成1×10-1的稀釋液，取1 mL 1×10-1的稀釋液于含有9 mL牛奶的試管中，振蕩搖晃使之混勻，制成1×10-2的稀釋液，取1×10-1的稀釋液7.5 mL于含有2.5 mL牛奶的試管中制成1×10-1×75%的稀釋液，以相同方法制成1×10-1×50%，1×10-1×25%，1×10-2×75%，1×10-2×50%，1×10-2×25%的稀釋液。試驗檢測用的8個樣品（空白樣品除外），其高濃度和低濃度區間跨度較大，且樣品可能存在分布不均狀態，人為操作也可存在誤差，綜合考慮選擇1×10-2×100%和1×10-2×25%中間2個樣品為測試樣，選擇其余樣品為校正樣。

1.2.4 試驗參數設置

牛奶中成分比較復雜，其各干擾成分均能產生相應的熒光，試驗選擇激發波長范圍為250~550 nm，發射波長范圍為265~700 nm，間隔2 nm取一個數據，其中狹縫的寬度選擇5.0/5.0 nm，掃描速度為2 400 nm/min[13]。

1.2.5 數據處理

牛奶體系中成分十分復雜，存在眾多干擾因素，因而無法確定準確組分數，故試驗使用ATLD算法的二階校正方法進行計算，并利用交替最小二乘原理對多維數據進行解析。該方法在定量分析上速度快且準確度高。

（1）三線性成分模型。使用激發發射熒光光譜儀，在選定的i個激發波長，j個發射波長下對K個樣品（包括校正樣和測試樣）進行掃描并將吸光度值收集在一個大小為i×j×M的三維數據陣X中，該三維數據陣中的每個元素xijk，用數學公式表示如下[14]：

式中：i=1，2，……i；j=1，2，……j；k=1，2，

……K；

xijk——立體陣X的元素（i，j，k），即第k個樣本在第i個激發光波長和第j個發射波長下的熒光強度；

ain——相對激發光譜矩陣A（I×N）中的元素（i，n）；

bjn——相對發射光譜矩陣B（J×N）中的元素（j，n）；

ckn——相對濃度矩陣C（K×N）中的元素（k，n）；

eijk——殘差陣E(I×J×K)中的元素（i，j，k）；

N——組分數，即對體系做出貢獻的總的組分數，包括感興趣的組分、背景和未校正的干擾等。

（2）ATLD算法。ATLD算法利用最小二乘原理，借助基于切尾奇異值分解（T-SVD）的Moore-Penrose廣義逆計算進行三線性數據分解。令a(i)、b(j)、c(k)分別表示矩陣A、B、C中的第i、j、k行，則三維三線性矩陣可表示為[14]：

式中：a(i)、b(j)、c(k)可分別通過最小化損失函數得出，損失函數指的是殘差矩陣元素的平方總和，函數如下[15]：

式中：||.||F2表示Frobenius矩陣范數，Xi..、X.j.、X..k分別是三維響應數陣X沿著激發光波波長、發射光波長及所測物質濃度方向的第i、j、k個切片。基于迭代計算步驟的ATLD二階校正法以切片矩陣方式進行計算，迭代過程中，B和C作歸一化處理[14]。

（3）品質因子。一般采用靈敏度（SNE）、選擇性（SEL）、檢出限（LOD）等指標來對方法的性能進行評估。SNE指的是單位濃度純分析信號，SEL指的是靈敏度與總信號的比值，由公式（8）和（9）計算[16-17]，LOD[18]可以用3個背景空白樣預測濃度的標準偏差的3倍表示。

式中：nm——矩陣中的（n，n）個元素；

*——Hadamard積；

k——單位濃度組分n的總信號，表示濃度得分參數。

2 結果與分析

2.1 牛奶中沙門氏菌的三維熒光光譜

牛奶中的沙門氏菌三維熒光光譜見圖2，牛奶中沙門氏菌的等高線熒光光譜見圖3。

由圖2可以看出，沙門氏菌三維熒光光譜的發射光在波長550~675 nm范圍內存在一個較寬的譜峰，其峰值為610 nm，且隨著激發光強度的增強譜峰強度逐漸增強，特征峰顯著。由圖3可以看出，在波長455~535 nm范圍內和波長390~530 nm范圍內存在2個特征吸收峰，通過圖譜分析發現其分別為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和甲醛脫氫酶（FADH），且2個特征吸收峰均產生紅移現象。牛奶中沙門氏菌的三維熒光光譜和等高線熒光光譜均可作為沙門氏菌檢測的依據，三維熒光光譜檢測允許存在未知的各種干擾因素，可同時檢測分析出多個樣品的重疊光譜信號，從而用于快速、準確地檢測出牛奶中沙門氏菌殘留。

圖2 牛奶中的沙門氏菌三維熒光光譜

圖3 牛奶中沙門氏菌的等高線熒光光譜

2.2 牛奶中沙門氏菌的定量分析

采用ATLD算法對通過三維熒光掃描得到的三維數據進行解析[19]。

ATLD法與三維熒光結合測定牛奶中沙門氏菌（N=3）見表1。

表1 ATLD法與三維熒光結合測定牛奶中沙門氏菌（N=3）

當組分為2時，ATLD算法所得校正集中沙門氏菌的相對濃度與試劑濃度相關系數為0.996 1，預測樣中沙門氏菌平均回收率為93.5%±2.3%。

ATLD算法獲得品質因子數見表2。

表2 ATLD算法獲得品質因子數

由表2可知，ATLD算法能較好地分辨出沙門氏菌所激發的熒光光譜，可實現對牛奶中沙門氏菌的直接快速定量檢測，同時也進一步證明二階校正法的“二階優勢”[20]。

3 結論

沙門氏菌是牛奶在生產、加工及運輸過程中主要防治的病原微生物污染源。牛奶中含有豐富的營養物質，使得整個檢測體系成分復雜，利用三維熒光光譜技術，結合基于ATLD的二階校正算法，直接快速對牛奶中沙門氏菌進行定量分析。與常規的檢測方法相比，該方法利用二階校正的“二階優勢”，成功地解決了檢測體系中復雜成分的干擾問題，實現牛奶中在干擾物共存下對沙門氏菌的快速檢測。