濁點萃取-氣相色譜法同時測定6種有機磷農(nóng)藥

謝美儀， 姜 勛， 劉煒婷， 郝曉棠， 劉甜恬， 鄭 涵， 王 梅

(廣東藥科大學公共衛(wèi)生學院，廣東廣州 510310)

我國是農(nóng)業(yè)大國，為防治病蟲害，使用農(nóng)藥是提高糧食產(chǎn)量的重要手段。有機磷農(nóng)藥(Organophosphorus Pesticides，OPPs)因防治對象多而被廣泛應(yīng)用，但由于長期大量施用，OPPs殘留問題日益嚴重，殘留在環(huán)境中的OPPs會通過水、空氣、食物等途徑影響人體健康[1-3]。OPPs與生物體內(nèi)的膽堿酯酶結(jié)合，造成乙酰膽堿積累，使人出現(xiàn)中毒癥狀，并且長期接觸OPPs會破壞人體的生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)，產(chǎn)生無法逆轉(zhuǎn)的損害。因此，建立環(huán)境中OPPs殘留的快速、靈敏的測定方法非常有必要。

OPPs大多具有揮發(fā)性和良好的熱穩(wěn)定性，氣相色譜法(GC)對于OPPs的分離測定有著顯著的優(yōu)越性，同時火焰光度檢測器(FPD)可選擇性和敏感地檢測有機磷化合物，因此GC-FPD被廣泛應(yīng)用于OPPs的檢測中。但實際樣品中OPPs的含量常在痕量水平，且環(huán)境基質(zhì)復雜，因此樣品需要前處理后才能準確測定。傳統(tǒng)的前處理技術(shù)如液-液萃取和固相萃取可以分離富集OPPs，但存在有機溶劑用量大，毒性高的問題。濁點萃取(CPE)用低毒的表面活性劑做萃取劑，可以大幅度減少有機溶劑的使用，實現(xiàn)對基質(zhì)復雜的環(huán)境樣品中OPPs的分離富集。

本實驗選擇6種極性不同的OPPs為研究對象，優(yōu)選聚乙二醇6000為萃取劑，通過加入無機鹽降低濁點溫度，在室溫下完成萃取。使用乙酸乙酯和正己烷混合溶劑對富集相進行反萃取，減弱了單一溶劑萃取時對極性的限制，在超聲輔助下，目標物進入有機相中，并注入GC儀檢測，成功建立CPE-GC聯(lián)用方法對6種OPPs的測定，并應(yīng)用于實際環(huán)境水樣和土壤中OPPs殘留的檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

GC-2010氣相色譜儀(日本，島津)，附FPD檢測器。

標準品：敵敵畏(Dichlorvos，美國Sigma-Aldrich)；毒死蜱(Chlorpyrifos)、甲基對硫磷(Methyl Parathion)、二嗪磷(Diazinon)、樂果(Dimethoate)、馬拉硫磷(Malathion)均來源于德國Dr.Ehrenstorfer公司。有機磷農(nóng)藥標準儲備溶液：準確稱量6種OPPs各10.00 mg，用甲醇溶解定容，使終濃度為1.0 g/L。標準工作溶液：用甲醇稀釋6種有機磷農(nóng)藥儲備液至50～100 mg/L。于4 ℃保存以上儲備溶液與工作溶液，每10 d新制標準工作溶液。聚乙二醇6000(PEG 6000，美國Sigma-Aldrich)；丙酮、乙酸乙酯、正己烷均為分析純(天津市百世化工有限公司)；異辛烷(分析純，德國Dr.Ehrenstorfer)。水為超純水。

1.2 儀器工作條件

RTX-1701型毛細管柱色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Restek)。設(shè)定進樣口溫度為240 ℃，檢測器溫度為250 ℃，載氣為高純氮，流速1.0 mL/min，進樣量1 μL。程序升溫：150 ℃(保持0.5 min)，以20 ℃/min升至185 ℃(保持2 min)，以20 ℃/min升至200 ℃(保持5 min)，以30 ℃/min升至230 ℃(保持3 min)；分流比為10∶1。

1.3 環(huán)境樣品的采集和保存

分別采集1 L的自來水水樣及河道水樣，水樣用0.45 μm水系濾膜過濾除渣，4 ℃冰箱避光保存，盡快測定。土壤樣品采集后帶回實驗室立即進行風干、研細、過篩并采用四分法取樣。

1.4 濁點萃取過程

于15 mL尖底塑料離心管中，依次加入1 mL pH=6.0的磷酸鹽緩沖溶液，0.60 g PEG 6000和1.0 mol/L 的無水Na2SO4，隨后加入一定量標準工作溶液或樣品溶液(8 mL環(huán)境水樣/2 g土壤樣品)，用超純水定容至10 mL，振蕩搖勻5 min，3 500 r/min離心3 min。吸棄下層水相后，在富集相中加入300 μL乙酸乙酯∶正己烷混合液(65∶35,V/V)。超聲反萃取20 min，離心1 min后，取上層有機相上機測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖溶液pH的優(yōu)化

甲基對硫磷和樂果在堿性溶液中會水解[13]，不能被疏水性膠束萃取，因此本實驗考察了pH在3.0～8.0的范圍內(nèi)對萃取效果的影響，見圖1。結(jié)果表明，隨著溶液pH增大，除樂果外其余5種OPPs的峰面積均呈逐漸上升的趨勢，在pH=6.0時萃取效果最佳。而樂果受pH的影響較小，峰面積隨著pH的增大呈緩慢增大，在pH=7.0時達到最佳并保持穩(wěn)定。因此，緩沖溶液pH選定為6.0。

圖1 pH對萃取效果的影響Fig.1 Effect of pH on extraction efficiency

2.2 表面活性劑的優(yōu)化

通過對表面活性劑種類的考察，發(fā)現(xiàn)CPE中常用表面活性劑Triton X-114的萃取效果不佳，而兩端親水的PEG 6000對微溶于水的OPPs萃取效果更好，同時由于鹽析的輔助作用更利于OPPs被萃取到富集相中。因此，選擇PEG 6000作為萃取劑。在Na2SO4的加入量為2 g的條件下，實驗考察3%～8%PEG 6000對6種OPPs的萃取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。當PEG 6000濃度為6%時，除樂果外其余5種目標物的峰面積達到最高。樂果峰面積整體呈些許下降趨勢。綜合考慮，選擇PEG 6000的最佳濃度為6%。

圖2 PEG 6000濃度對萃取效果的影響Fig.2 Effect of PEG 6000 concentration on extraction efficiency

2.3 電解質(zhì)的選擇與優(yōu)化

無機電解質(zhì)的加入可降低PEG 6000的濁點溫度(CPT>100 ℃)，并且通過鹽析作用可提高目標物的萃取效果。實驗選擇加入Na2SO4來降低PEG 6000的濁點溫度。加入0.8 mol/L Na2SO4和6%PEG 6000即可在常溫下產(chǎn)生濁點現(xiàn)象。因此實驗研究了0.8～1.6 mol/L Na2SO4對萃取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。實驗發(fā)現(xiàn)，除樂果外其余5種分析物濃度大于1.0 mol/L后峰面積變化不大；樂果峰面積在考察濃度范圍平穩(wěn)，故實驗選擇Na2SO4濃度為1.0 mol/L。

圖3 無水NaSO4濃度對萃取效果的影響Fig.3 Effect of Na2SO4 concentration on extraction efficiency

2.4 反萃取劑的選擇與優(yōu)化

反萃取劑的選擇是實現(xiàn)CPE與GC聯(lián)用的關(guān)鍵。選取的有機溶劑需滿足以下兩點：一要與PEG 6000不互溶，二要對目標物有良好的溶解性。同時基于與GC的良好適配性考慮，實驗選取了不同極性的乙酸乙酯、正己烷和異辛烷作反萃取劑，考察了這3種有機溶劑對OPPs萃取的效果(圖4)。實驗發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯對甲基對硫磷、馬拉硫磷、敵敵畏、樂果的萃取效果明顯優(yōu)于正己烷和異辛烷，但正己烷對二嗪磷和樂果的萃取能力要明顯高于乙酸乙酯和異辛烷。為兼顧目標物的極性，分別將極性較小的乙酸乙酯與極性大的正己烷和異辛烷進行1∶1混合萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對其中5種目標物的萃取效果均升高，乙酸乙酯與正己烷混合萃取時的效果更佳。于是進一步探討乙酸乙酯與正己烷的配比以使萃取效果達到最優(yōu)，結(jié)果如圖5所示。最終優(yōu)選乙酸乙酯與正己烷的配比為65∶35。實驗探討了乙酸乙酯∶正己烷混合液(65∶35)用量在100～600 μL范圍對6種OPPs萃取的影響，經(jīng)按有機相體積折算，比較粗萃取率后，最終選擇加入300 μL有機溶劑進行后續(xù)研究。

圖4 反萃取劑種類對萃取效果的影響Fig.4 Effect of back extractant type on extraction efficiencyA:Ethyl acetate;B:Isooctane;C:n -hexane.

圖5 乙酸乙酯含量對萃取效果的影響Fig.5 Effect of ethyl acetate content on extraction efficiency

2.5 超聲時間的優(yōu)化

實驗考察了超聲時間在5～30 min范圍內(nèi)對6種OPPs萃取的影響。當超聲時間在5～20 min時，隨著超聲時間的增加，除樂果外其余5種OPPs的峰面積均出現(xiàn)不同程度的增大，并在20 min的超聲時間達到最大。而樂果的峰面積受超聲時間影響較小。因此，選擇20 min的超聲時間進行后續(xù)研究。

2.6 搖勻和離心時間的優(yōu)化

實驗過程中，將溶液振蕩一定時間以利于膠束捕獲疏水性目標物進入富集相中。實驗考察了搖勻時間在3～20 min對6種OPPs萃取的影響。結(jié)果顯示：當搖勻時間為5 min時，6種分析物的峰面積即達到最大，之后峰面積保持穩(wěn)定不變。因此搖勻時間選擇5 min。

本方法中共有兩次離心，第一次是在CPE中，為加速水相與富集相的分離。考察了第一次離心時間在1～8 min內(nèi)對萃取的影響，發(fā)現(xiàn)各目標物峰面積無明顯變化，為保證分相充分，選擇3 min為第一次離心時間。在反萃取過程中，有機溶劑和富集相分離后，仍有部分溶液在管壁上殘留，為使有機相更加澄清透明，對溶液進行第二次離心。實驗發(fā)現(xiàn)，1 min的離心時間已足夠使有機相澄清透明。

2.7 方法學特征

在最優(yōu)的實驗條件下，對方法的線性范圍、檢出限(LOD)、富集倍數(shù)等指標進行評價，LOD由3倍信噪比(S/N)計算，富集倍數(shù)=萃取后工作曲線斜率/萃取前工作曲線斜率；同時為考察方法精密度，對6種OPPs在50～100 μg/L濃度范圍內(nèi)的混標進行6次平行萃取測定，結(jié)果見表1。方法LOD為0.8～5.0 μg/L，除樂果外其余5種OPPs的富集倍數(shù)≥16.4，而樂果的富集倍數(shù)為5.48，相對標準偏差(RSD)在3.38%～5.18%范圍內(nèi)，適用于痕量OPPs的定量分析。

表1 有機磷農(nóng)藥的分析特征Table 1 Analysis characteristics of organophosphorus pesticides

2.8 環(huán)境樣品檢測

將建立的方法應(yīng)用于測定環(huán)境水樣和土壤樣品中OPPs含量，并進行加標回收實驗(表2)。結(jié)果顯示，在水樣2、3和土壤樣品1、3中檢測到敵敵畏，濃度為12.4～23.3 μg/L，水樣2、3中檢測到毒死蜱，濃度為30.6～85.4 μg/L。樣品的加標回收率在89.7%～109.9%之間，表明方法的準確性和實用性較好。

表2 環(huán)境樣品分析結(jié)果和加標回收率Table 2 Environmental samples analysis results and recoveries

3 結(jié)論

本文建立了CPE結(jié)合GC-FPD法測定環(huán)境水樣和土壤中6種極性各異的OPPs殘留的方法，通過進行反萃取，成功將富集相中的目標物萃取到有機溶劑中，解決了CPE與GC聯(lián)用時堵塞進樣孔的問題。通過對乙酸乙酯、異辛烷和正己烷三種有機溶劑的優(yōu)選，最終使用少量的反萃取劑(體積比65∶35的乙酸乙酯∶正己烷混合溶劑)即可達到完全去除上機樣品中表面活性劑的效果，并且兼顧了對極性差異較大的分析物同時進行分離富集的目的。本文建立的方法適用于環(huán)境水樣和土壤中OPPs的測定，尤其適用于對極性差異較大樣品的檢測。