分散固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法同時測定豬肉中的10種利尿劑

趙曉亞*， 陳新艷， 王 晗， 葉 誠， 曹 維， 鄭茜玥， 王 鵬

(武漢海關技術中心，湖北武漢 430050)

利尿劑是臨床常用藥物，廣泛應用于利尿消腫、降壓和腦水腫等的治療。近年來，利尿劑也被用于家畜的養殖及疾病治療中，因而在許多動物源性食品可能存在殘留。利尿劑進入人體后，可直接或間接導致腎臟功能和組織學改變，通過細胞外容量的減少、入球和出球小動脈張力的改變和球-管反饋等機制，導致腎血流量的減少和腎小球濾過率的下降。其還可引起急性間質性腎炎、腎小管堵塞等腎臟損害，長期攝入利尿劑可導致腎結石、尿沉渣異常和低鉀性腎病等慢性改變，具有較強的腎毒性作用[1 - 8]。

目前，文獻報道的利尿劑的檢測方法主要是高效液相色譜和液相色譜-質譜聯用技術，檢測對象集中在人體及動物的尿液[9 - 12]和血液[13,14]、飼料[15]、保健品或者功能食品[16 - 18]等。針對動物源性食品中利尿劑的檢測方法報道非常少。因此，本文建立了豬肉中氫氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺內酯、坎利酮10種利尿劑殘留的高效液相色譜-串聯質譜分析方法，該方法具有快速、靈敏、定性定量準確的特點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP 5500液相色譜-串聯質譜聯用儀(美國，AB SCIEX)；GM200刀式研磨儀(德國，Retsch)；ML303/02電子天平(美國，METTLER TOLEDO)；2-16PK型低溫離心機(德國，Sigma)；MS2型漩渦混合儀(德國，IKA)，TurboVap LV型氮吹儀(瑞典，Biotage)；Milli-Q超純水器(美國，Millipore)。

10種利尿劑標準品：氫氯噻嗪(Hydrochlorothiazide,Dr)、氯噻嗪(Chlorothiazide,Dr)、氨苯喋啶(Triamterene,TMstandard)、丙磺舒(Probenecid,CATO)、氯噻酮(Chlorthalidone,TMstandard)、乙酰唑胺(Acetazolamide,LGC)、呋塞米(Furosemide,TMstandard)、精磺胺(4-Amino-6-chlorobenzene-1,3-disulfonamide,TMstandard)、螺內酯(Spironolactone,BePure)、坎利酮(Canrenone,TMstandard)，純度≥98%。分別稱取10種利尿劑標準品，用甲醇溶解(氨苯喋啶先用少量冰HAc溶解)，配制成質量濃度為0.5 mg/mL標準儲備溶液，于-18 ℃保存。在實驗過程中精確吸取適量標準溶液，用甲醇溶液逐級稀釋至所需分析物濃度。甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，德國Merck)；KH2PO4、無水MgSO4(分析純)；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、石墨化碳黑(GCB)用于實驗。

豬肉樣品購于武漢集貿市場。

1.2 樣品前處理

稱取2 g試樣，置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈和2 g KH2PO4，振蕩提取30 min后，于0 ℃以9 000 r/min離心5 min，取出上清液，再向殘渣中加入10 mL乙腈重復提取1次，離心后合并上清液，置于50 mL離心管中，待凈化。

在待凈化上清液中加入150 mg無水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18、10 mg GCB，渦旋混合30 s后，于0 ℃以9 000 r/min離心5 min，取全部上清液于45 ℃下用氮氣吹至近干，準確加入2.0 mL初始流動相溶液溶解殘渣，溶液過0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動相為水(A)和0.1%甲酸甲醇溶液(B)。梯度洗脫程序：0～1.0 min，B保持10%；1.0～3.5 min，B從10%變為65%；3.5～11.0 min，B從65%變為97%；11.0～11.5 min，B從97%變為10%；11.5～15.0 min，B保持10%。流速0.3 mL/min；進樣量5 μL；柱溫30 ℃。

1.3.2 質譜條件電噴霧離子源(ESI)，正負離子掃描；多反應監測(MRM)模式檢測；氣簾氣壓力(CUR，kPa)：241(氮氣)；霧化氣壓力(GS1，kPa)：414(氮氣)；輔助氣壓力(GS2，kPa)：355(氮氣)；正離子掃描電噴霧電壓(IS)：5 000 V；負離子掃描電噴霧電壓(IS)：-4 500 V。碰撞能量(CE)、去簇電壓(DP)等。主要質譜參數如表1所示。

表1 10種利尿劑的主要參考質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters of 10 kinds of diuretics for LC-MS/MS

2 結果與討論

2.1 溶液穩定性

本工作對標準儲備溶液和混合標準中間溶液的穩定性進行了考察。10種利尿劑的0.5 mg/mL儲備溶液在-18 ℃保存條件下，在1、10、20、30、45、60、75、90 d時，分別取10種利尿劑的儲備溶液用甲醇混合稀釋成10.0 ng/mL，考察了儲備溶液的穩定性。1.0 μg/mL混合標準中間溶液在4 ℃保存條件下，在1、10、20、30、45 d 時用甲醇混合稀釋成10.0 ng/mL，考察了混合標準中間溶液的穩定性。結果表明，在90 d內標準儲備溶液變化為99.4%～99.7%，在45 d內混合標準中間溶液變化為99.6%～99.1%。

2.2 提取條件的選擇

10種利尿劑均為具有一定極性的化合物，適合采用極性溶劑進行提取，故用乙酸乙酯、乙腈、甲醇作為提取溶劑進行了提取效果對比。在空白基質中添加20 μg/kg的利尿劑標準品作為測試樣品，結果表明乙腈的提取率較高且干擾少。對比了在提取過程中加入無水N2SO4、KH2PO4、無水MgSO4、NaCl、檸檬酸鈉對提取效率的影響，結果表明加入KH2PO4時的回收率比較高。

2.3 凈化條件的選擇

常用的QuEChERS凈化材料包括PSA、C18和GCB，通常還會加入無水MgSO4去除水分。本實驗采用正交試驗對各凈化劑的用量進行了優化，正交試驗條件如表2所示。不同凈化劑比例條件下的凈化結果如表3所示。結果表明，第2組凈化劑比例條件下的凈化效果較好。因此，在后續凈化中采用150 mg無水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18、10 mg GCB這一添加比例。

表2 正交試驗表Table 2 Parameters for orthogonal test

表3 不同吸附劑比例對凈化效果的影響Table 3 Purification effect of different amount of adsorbents

2.4 線性關系、檢出限和重現性

在最優的實驗條件下，方法學考察表明，豬肉中氫氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮的檢出限為2.0 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg；乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺內酯、坎利酮的檢出限為5.0 μg/kg，定量限為10.0 μg/kg。圖1為空白豬肉基質中添加10種利尿劑定量限濃度的提取離子色譜圖。氫氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮的線性范圍為5～100 μg/L，乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺內酯、坎利酮的線性范圍為10～200 μg/L，線性關系如表4中所示。

表4 豬肉中10種利尿劑的線性關系Table 4 Linear relationship of 10 kinds of diuretics in pork

圖1 空白豬肉基質及其添加10種利尿劑的提取離子色譜圖。(A)正離子模式空白樣品；(B)正離子模式加標樣品;(C)負離子模式空白樣品；(D)負離子模式加標樣品。Fig.1 Extracted ion chromatograms of blank pork and spiking sample.(A)Blank sample of positive ion mode;(B)Spiked sample of positive ion mode(Triamterene：5.64 min,probenecid:9.33 min,spironolactone:9.42 min,canrenone:9.86 min);(C)Blank sample of negative ion mode;(D)Spiked sample of negative ion mode(Hydrochlorothiazide:4.86 min,chlorothiazide:4.71 min,chlorthalidone:6.23 min,acetazolamide:5.01 min,furosemide:7.02 min,4-amino-6-chlorobenzene-1,3-disulfonamide:4.13 min).

2.5 方法的回收率和精密度

將本方法應用于市售的豬肉樣品中10種利尿劑的檢測，在實際樣品中均未檢出。因此，采用經測定不含目標物的豬肉樣品進行加入回收率和精密度實驗，結果見表5。10種利尿劑在空白豬肉基質中不同濃度水平的添加回收率在83.5%～96.6%之間，精密度(RSD)小于10.1%。

表5 豬肉樣品中10種利尿劑的加標回收率(n=7)Table 5 Recoveries of 10 kinds of diuretics in pork samples(n=7)

(續表5)

3 結論

本方法利用乙腈進行提取，分散固相萃取凈化，高效液相色譜-串聯質譜法對豬肉樣品中10種利尿劑殘留進行定性與定量檢測。該方法具有快速、準確、靈敏的特點，可用于日常豬肉樣品中氫氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺內酯、坎利酮殘留的定性及定量檢測。