銅納米簇熒光猝滅法測定林可霉素

李志英, 李健如

(忻州師范學院化學系，山西忻州 034000)

金屬納米簇是由幾個或者幾十個原子組成的相對穩定的結構體,尺寸小于10 nm，接近電子的費米波長，特有的量子尺寸效應使得其在光學和電學上具有隨粒徑大小變化而改變的性質[1]。相對于Au和Ag納米簇,Cu納米簇(Cu NCs)報道較少。Cu NCs由幾個至幾十個Cu原子所組成[2]，是一種可代替有機熒光團的新型熒光探針[3],由于其獨特的尺寸依賴性,具有不同于原子或塊狀Cu的物質的電子性質和光學性質,且使用廣泛、原料廉價和自然含量豐富等優點[4]，具有良好的應用前景。但是Cu NCs在水溶液中的粒徑大小及穩定性都很難控制,目前對于Cu NCs的研究仍處于發展階段[5]，因此，研究一種穩定且粒徑小的Cu NCs是科研工作的一個熱點。

林可霉素(Lincomycin,Lin)為林可胺類抗生素，臨床上主要用于治療革蘭氏陽性菌，特別是耐青霉素的革蘭氏陽性菌所引起的各種感染，也可以直接乳房注射治療奶牛的乳房炎;6]，因此在牛奶和豬肉里可能有該抗生素殘留，影響消費者的身體健康,所以研究一種快速、簡單測定林可霉素的方法是非常必要的。現有測定林可霉素的方法有質譜法[7]、高效液相色譜法[8]、化學發光法[9]、酶聯免疫吸附法[10]、背景熒光免疫層析法[11]等。這些方法有的儀器價格昂貴，有的樣品前處理復雜，不適合現場快速檢測。本方法采取化學還原的方法以CuCl2為原料，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)為模板，2-巰基苯并噻唑(MBT)為穩定劑，葡萄糖為還原劑，于常溫下合成水溶性好且穩定、發射黃綠色熒光的Cu NCs。林可霉素對Cu NCs的熒光具有猝滅作用，據此建立了檢測林可霉素含量的熒光分析新方法。該方法具有操作簡便、檢出限低、準確度高，可用于測定豬肉、牛奶等動物源性食品中林可霉素殘留量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC熒光分光光度計(島津(蘇州)公司);UV-2550紫外分光光度計(島津(蘇州)公司);Tecnai G2 F205-TWIN透射電子顯微鏡(美國，FEI公司)。

林可霉素標準品(江蘇艾康生物醫藥研發有限公司,CAS No.:859-18-7，純度88%)溶液：準確稱取0.0044 g林可霉素，溶解后將其定容到100 mL的容量瓶中，得到1.0×10-4mol/L儲備液，避光保存。林可霉素注射液(天方藥業有限公司、山東方明藥業集團股份有限公司2 mL:0.6 g)溶液：精密吸取鹽酸林可霉素注射液1 mL，用二次蒸餾水稀釋到10 mL比色管中，制得含林可霉素6.77×10-5mol/L的溶液。2-巰基苯并噻唑(MBT，天津市光復精細化工研究所)溶液：準確稱取0.0417 g MBT，加1.0 mol/L NaOH溶液1 mL溶解后，將其定容到25 mL的容量瓶中，得1.0×10-2mol/L的儲備液，在4 ℃的冰箱里放置12 h后使用。聚乙烯吡咯烷酮(K30)(PVP，天津市光復精細化工研究所)溶液；準確稱取1.25 g PVP，溶解后定容到25 mL的容量瓶中，得1.0×10-3mol/L的儲備液。CuCl2(天津市化學試劑三廠)。實驗所用藥品均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 Cu NCs的制備于25 mL比色管中，依次加入0.5 mL 1.0×10-2mol/L CuCl2溶液，1.5 mL1.0×10-3mol/L PVP溶液，1.5 mL 1.0×10-2mol/L MBT溶液，1.5 mL 1.0×10-4mol/L葡萄糖溶液，用二次蒸餾水定容到25 mL，混合均勻，靜置10 min后，于4 ℃的冰箱中保存(48 h內使用)。

1.2.2 林可霉素的檢測取兩支25 mL比色管，各加入0.5 mL Cu NCs溶液，2 mL pH=5.0的HAc緩沖溶液，其中一支加入0.5 mL 1.0×10-4mol/L林可霉素溶液，用二次蒸餾水定容到25 mL。室溫下放置40 min后，用1 cm比色皿，設定狹縫寬度為10 nm，在激發波長355 nm，發射波長580 nm下分別測量熒光強度F0、F，計算ΔF(ΔF=F0-F)。

2 結果與討論

2.1 Cu NCs的合成條件優化

考察了合成Cu NCs各種原料的用量。按“1.2.1”，固定其它條件不變，分別改變1.0×10-2mol/L CuCl2溶液，1.0×10-2mol/L MBT溶液，1.0×10-3mol/L PVP溶液和1.0×10-4mol/L葡萄糖溶液的用量，定容到25 mL制備Cu NCs，在激發波長335 nm下測量熒光光譜。結果表明:葡萄糖用量為1.5 mL，PVP用量為2.5 mL，MBT用量為2.5 mL，CuCl2用量為0.7 mL時Cu NCs的熒光最強。所以以上用量為制備Cu NCs的最佳條件。

2.2 Cu NCs穩定性實驗和熒光量子產率

取0.5 mL Cu NCs溶液，固定其他條件不變，只改變溫度、放置時間，光照、pH、氧化還原劑，測定Cu NCs的穩定性。結果表明:pH為5～7、溫度為30 ℃時熒光最強，Cu NCs放置時間為10 min以后2 h內基本穩定，光照影響較小，加入0.25%的H2O2溶液作為氧化劑，以30 mg/L的Na2SO3溶液作為還原劑，分別測定Cu NCs 熒光強度的變化。結果表明加入H2O2和Na2SO3，體系熒光強度變化較小。

測量所合成的Cu NCs在335 nm處的吸光度和熒光發射光譜。以上所測得的所有熒光發射光譜用Origin軟件求得峰面積。Cu NCs的量子產率根據如下公式計算[12]:ΦX=ΦR×(IX/IR)×(AR/AX)。式中，I代表熒光發射曲線的峰面積，A指吸光光度值，Φ指熒光量子產率值，下標X代表待測物，R代表標準物選取硫酸奎寧作為基準物質，已知其在激發波長為335 nm處的熒光量子產率為0.54,計算得Cu NCs 的熒光量子產率為0.47。

2.3 Cu NCs的表征

為了表征原料和產物的關系，分別配制1.0×10-3mol/L CuCl2溶液，1.0×10-2mol/L MBT溶液，1.0×10-3mol/L PVP(K30)，1.0×10-4mol/L葡萄糖溶液。取0.5 mL的Cu NCs溶液定容到25 mL，用1 cm比色皿，測定250～450 nm處的紫外-可見光譜，結果如圖1。上述溶液在335 nm激發波長下測定熒光光譜，結果如圖2。圖1中曲線1、2、3說明CuCl2、PVP、葡萄糖在350 nm處沒有吸收，曲線4說明MBT只在280 nm處有吸收，曲線5說明Cu NCs在368 nm處有吸收，說明其它原料不影響Cu NCs對紫外光的吸收;圖2曲線1表明Cu NCs在335 nm激發波長下，于580 nm左右出現較強的熒光;其它曲線說明CuCl2、PVP、葡萄糖、MBT溶液在580 nm處沒有熒光。說明生成了Cu NCs，并且原料對Cu NCs的熒光沒有干擾。

圖1 Cu NCs體系的紫外光譜圖Fig.1 The UV spectra of Cu NCs system

圖2 Cu NCs及各原料的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of Cu NCs and each raw material

為了表征是否生成了Cu NCs，把生成的Cu NCs溶液在普通微柵支持膜上附著三次，在紅外燈下照射干燥，然后在Tecnai G2F205-TWIN透射電子顯微鏡(TEM)下進行檢測，結果如圖3。用X射線光電子能譜(XPS)測定Cu NCs體系各元素的化學狀態，Cu的化學狀態如圖4。由圖3可知，合成的Cu NCs的粒徑分布均勻并基本呈球形，其平均粒徑為5～7 nm左右。采用XPS測定樣品中Cu的氧化狀態，從全圖來看，有C、O、N、S、Cu元素，從譜圖4中看到，在932.3 eV和952.0 eV處觀察到兩個強烈的峰，這兩個峰代表了Cu(0) 的2p3/2和2p1/2特征，證明合成了Cu NCs。

圖3 Cu NCs透射電鏡(TEM)圖Fig.3 TEM image of Cu NCs

圖4 Cu NCs 中Cu 2p的X射線光電子能譜(XPS)圖Fig.4 XPS spectrum of Cu 2p for Cu NCs

2.4 測定林可霉素體系的熒光光譜圖

于25 mL比色管中，各加入pH=5.0的乙HAc緩沖溶液2 mL，再分別加入0.5 mL Cu NCs，0.5 mL 1.0×10-4mol/L的林可霉素，同濃度的Cu NCs和林可霉素的混合物，用二次蒸餾水定容到25 mL，在激發波長335 nm處測得各自熒光強度，得到圖5。圖5表明:曲線1為Cu NCs 在580 nm處有較強的熒光，曲線3為林可霉素在580 nm處沒有熒光，曲線2說明林可霉素加入Cu NCs溶液使其熒光猝滅，可以選擇性測定林可霉素。實驗測得林可霉素可以猝滅450 nm處MBT的熒光，推測林可霉素中季氨氮容易與巰基反應，結果MBT對Cu NCs的保護作用減弱，Cu NCs加大團簇趨勢，熒光猝滅。

圖5 林可霉素對Cu NCs作用的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra revealing the effects of lincomycin on Cu NCs

2.5 pH、反應時間和溫度對體系的影響

用NaOH溶液和HCl調節測定體系的pH，研究pH對體系的影響。ΔF隨pH的升高先增大后減小，當反應溶液pH=5.0,溶液的ΔF最大，即林可霉素對Cu NCs的熒光猝滅效果最好。所以本實驗選用pH=5.0的HAc緩沖體系2 mL為反應介質。

體系在5 min后反應完全，并且在40 min時ΔF最大，以后基本不變，為方便測定故實驗選擇在40 min后測定。設定20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃不同的溫度進行反應。結果表明:當反應溫度為30 ℃時，溶液的ΔF最大，即林可霉素對Cu NCs的熒光猝滅效果最好。

2.6 工作曲線和檢出限

按“1.2.2”的實驗方法，取兩支25 mL的比色管，準確加入0.5 mL的Cu NCs溶液，然后分別加入1.0×10-4mol/L、1.0×10-5mol/L、1.0×10-6mol/L、1.0×10-7mol/L林可霉素溶液，以不加林可霉素溶液作為空白，在激發波長335 nm處測定熒光強度，測定結果如圖6。結果表明:林可霉素在濃度為4.0×10-8～8.0×10-7mol/L和8.0×10-7～2.0×10-5mol/L范圍呈良好的線性關系，其線性關系式分別為：ΔF=210.8c+19.29(c，μmol/L)；ΔF=28.42c+251.1(c，mol/L)，相關系數(r)分別為0.9956 和0.9922。做11次空白試驗，求得其標準偏差(δb)，利用3δb/K公式求得檢出限為1.01×10-8mol/L。

圖6 不同濃度林可霉素下Cu NCs的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of Cu NCs with different concentrations of lincomycin

2.7 共存物質干擾測定

2.8 樣品的檢測和加標回收率

選擇兩個不同廠家的林可霉素注射液，取1 mL稀釋后的林可霉素注射液分別為樣品1和樣品2。吸取伊利牛奶樣品18 mL置于40 mL離心管中，加入1 mL 20%HAc溶液和1 mL二次蒸餾水。旋渦振蕩5 min，于 4 ℃冷藏保存20 min。以6 000 r/min的轉速離心10 min，吸取上清液。沉淀再加5 mL二次蒸餾水，旋渦振蕩5 min，離心10 min，合并上清液[13]，得樣品3和樣品4。4個樣品按“1.2.2”的方法進行測定，平行測定3次，求得標準偏差較小，可知方法精密度較好;分別加入被測樣的5、10、15 mL標準樣品測定回收率，由回收實驗可知，本實驗系統誤差較小。

表1 樣品的測定結果及回收率(n=3)Table 1 Determination results of sample and recoveries(n=3)

2.9 本法與液相色譜法比較

為了驗證Cu NCs熒光猝滅法和國家標準方法(液相色譜法)的差異，取牛奶樣品1 mL，分別加入一定量的林可霉素標準溶液，采用Cu NCs熒光猝滅法和國家標準方法檢測結果如表2。采用 SPSS 17.0 軟件，對Cu NCs熒光猝滅法測定值和國標法測定值經t檢驗分析(P>0.05)，兩種方法沒有顯著性差異。

表2 本法和國標法測定結果比較(x+s，n=3，μmol/L)Table 2 Comparison of the determination results of this method and the national standard method

3 討論

與傳統測定林可霉素的方法相比，本方法在常溫下合成水溶性好且穩定性好的Cu NCs，原料便宜，Cu NCs熒光量子產率較高，以此Cu NCs作為熒光探針檢測林可霉素，紫外燈下可視黃綠色變深，方法檢出限低，干擾較小，可用于制作光電傳感器。本研究可用于檢測林可霉素的殘留，結果與國標法的檢測結果用t檢驗分析，無明顯差異。本方法操作簡便，反應時間短，靈敏度高，可實現林可霉素的現場快速定量檢測，為食品安全領域快速檢測林可霉素奠定了基礎。