復合納米粒子修飾的柔性分子印跡傳感器對四環素的檢測研究

郭宣利， 王 玉， 王文廉*

(1.中北大學儀器科學與動態測試教育部重點實驗室，山西太原 030051；2.中北大學電子測試技術國家重點實驗室，山西太原 030051)

四環素(Tetracycline,TC)因為價格低且有較強的抗菌能力，被廣泛應用于畜牧業、水產養殖以及感染性疾病的預防和治療[1]。然而，過量添加四環素類藥物會造成其在肉類、牛奶、蜂蜜等動物源性食品中較高殘留，嚴重影響人體骨骼和牙齒[2]發育，對腎臟也有損傷[3]。世界衛生組織和歐盟規定牛奶中四環素最大殘留限量(MRL)為100 mg/L。所以建立一種可以快速便捷的測量食品、藥物中的四環素含量的方法具有重要意義。目前四環素的檢測主要有分光光度法[4]、高效液相色譜法[5]、化學發光法[6]、微生物法[7]、免疫法[8]和毛細電泳法[9]等方法。

分子印跡技術(Molecular Imprinting,MIT) 對特定目標分子具有選擇特異性，在分子識別、固相萃取、色譜分離等方面得到廣泛應用。金屬納米顆粒,諸如Au、Pt、Ag、Cu、Ni已經成為最熱門的增加電化學活性的電催化劑[10]。Au納米粒子(Au NPs)的比表面積大，用它作為增敏材料可有效提高電化學傳感器的靈敏度、生物相容性[11]以及穩定性。Cu納米粒子(Cu NPs)對一些生物分子具有很好的催化氧化[12]性能。Garaj等研究表明，合金納米粒子展現出多功能性和良好的協同性,它們在基礎研究和應用上比相對應的單一的金屬更具優勢[13]。近些年柔性可穿戴器件發展迅速，人們對于柔性電極的需求更加迫切。碳布(Carbon Cloth,CC)是制作柔性電極中最具有吸引力的材料之一[14]，它導電性良好，比表面積大，熱穩定性高，而且柔韌性好，耐磨，價格低。

本文用H2SO4作為活化劑活化碳布，使其更加柔軟且性能穩定。在碳布表面修飾Au-Cu NPs復合納米粒子作為工作電極測量四環素，與傳統玻碳電極相比電流響應顯著增強，同時抗干擾性和重復性良好，可用于牛奶中四環素的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI600E電化學分析儀(上海辰華有限公司)；KQ-500DE超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；DHG-9013A電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；BSA224S-CW電子天平(上海一恒科學儀器有限公司)；TG16-WS(磁力攪拌器上海實驗儀器有限公司)；SU-8010型掃描電子顯微鏡(日本，JEOL公司)。

四環素、卡那霉素、氯霉素、土霉素均購于百靈威試劑有限公司；鄰苯二胺購于Adamas(上海)有限公司；HAuCl4購于北京化學試劑有限公司；CuSO4、K3[Fe(CN)6]、H2SO4、KCl、甲醇、無水乙醇購于國藥集團化學試劑有限公司，以上試劑均為分析純。實驗用水為去離子水。

1.2 柔性分子印跡傳感器的制備

1.2.1 碳布的活化將碳布裁剪成1 cm×2 cm，用去離子水沖洗干凈。將洗干凈的碳布依次在丙酮、無水乙醇、去離子水中各超聲清洗15 min，然后放入H2SO4∶HNO3(體積比1∶3)混酸中浸泡過夜，次日取出用大量去離子水沖洗后，用碳布作為工作電極，在三電極體系下，將電極置于2 mol/L的H2SO4中，用循壞伏安法(CV)在0～2 V電位范圍內，以20 mV/s的掃速掃描20圈，取出用去離子水沖洗干凈得到酸化碳布(ACC)。

將酸化碳布放入烘箱干燥后，為了控制有效工作面積，在碳布1 cm×1 cm范圍上方涂覆一圈指甲油，然后用醫用膠帶包裹住。將電極在磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.01 mol/L)中循壞伏安掃描，直到曲線穩定后，活化電極制備成功，放置備用。

1.2.2 分子印跡傳感器的制備將碳布、Ag/AgCl電極、鉑網電極三電極浸入50 mmol/L H2SO4和20 mmol/L苯胺的混合溶液中，然后以25 mV/s的掃描速度進行循環伏安掃描，掃描結束取出聚苯胺(PAIN)/CC電極，去離子水洗滌，60 ℃下干燥備用。將制備好的PANI/CC電極浸入含有10 mmol/L HAuCl4、1 mol/L H2SO4和5 mmol/L CuSO4混合溶液中，然后通氮氣保存30 min，再在-0.6 mA/cm2的電流密度下聚合900 s，聚合過程中用磁子不斷攪拌。聚合結束取出電極，用大量去離子水沖洗，60 ℃下干燥，得到Cu-Au NPs/PANI/CC修飾電極。

以0.01 mol/L PBS配制含1 mmol/L四環素、5 mmol/L鄰苯二胺的混合溶液。將Cu-Au NPs/PANI/CC放在混合溶液中，利用循環伏安法在0～0.8 V的電位下，以50 mV/s的掃速，掃描40圈(期間對混合溶液進行緩慢的磁力攪拌)。將電聚合后的電極放在甲醇∶乙酸(體積比9∶1)洗脫液中洗脫10 min，除去模板分子四環素，即可得到四環素分子印跡電極(Au-Cu NPs/PANI/TC/CC)。

1.3 實驗方法

配制20 mL含有不同濃度四環素的0.1 mol/L PBS，將Au-Cu NPs/PANI/TC/CC修飾電極在配制好的溶液中孵育10 min后，在0.01 mol/L PBS中，利用差分伏安法(DPV)在0～0.6 V電位下掃描，記錄不同濃度四環素所對應的DPV峰值電流。

2 結果與討論

2.1 納米材料的表征

2.1.1 納米材料的掃描電鏡表征使用掃描電鏡(SEM)表征柔性傳感器的形貌。圖1A為未修飾碳布的SEM圖，從圖中可以看出碳布的管狀結構。圖1B為修飾過納米復合粒子的碳布傳感器SEM圖，可以看出，碳布的管狀結構上附著了納米級的顆粒結構，說明納米材料修飾成功，即Cu-Au NPs/PANI/CC傳感器制備成功。

圖1 修飾納米復合材料前(A)后(B)的碳布掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of carbon cloth before(A) and after(B) modification with nanocomposite

2.1.2 納米材料的電化學特性為了檢測活性材料的電催化能力，在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液和0.1 mol/L KCl溶液中，分別對裸碳布和Cu-Au NPs/PANI/CC修飾電極進行循環伏安測試，掃描速度為50 mV/s。結果如圖2所示。從圖中可以看出，未修飾納米復合材料的碳布電極的電流響應明顯低于修飾納米復合材料后的碳布電極，說明納米復合材料對碳布電極有明顯的電催化作用。

圖2 在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl溶液中碳布電極鍍材料前(a)和后(b)的循環伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of carbon cloth electrodes before(a) and after(b) plating materials in 5 mmol/L K3[Fe(CN)6] and 0.1 mol/L KCl solutions

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 碳布活化溶液分別用H2SO4和KOH溶液對碳布進行改性，比較后選擇出較好的活化方式。堿性活化在1 mol/L的KOH溶液中用陽極極化法在2.0 V 的電位下掃描200 s，其他步驟同酸化碳布的處理進行制備。比較堿化碳布、酸化碳布的電化學響應，發現酸化碳布的響應電流更大。所以本文采用酸化法對碳布進行活化。

2.2.2 沉積電流與時間采用DPV法研究沉積電流和沉積時間的影響。實驗結果表明，在沉積電流-0.8～-0.6 mA范圍內，峰值電流增大，而沉積電流大于-0.6 mA，峰值電流開始減小。當沉積時間在600～900 s時，峰值電流增大，繼續沉積，峰值電流減小。因此，當沉積電流為-0.6 mA，沉積時間為900 s時，響應電流達到最大值。

2.2.3 電聚合圈數在電聚合時可以通過控制聚合圈數來控制分子印跡膜的厚度。利用DPV法記錄其峰值實驗表明電聚合10～40圈時，峰值電流逐漸變大，電聚合40圈時峰值電流達到最大，當電聚合圈數大于40圈，峰值電流開始減小。

2.2.4 洗脫時間將電極浸泡到甲醇∶乙酸(體積比9∶1)溶液中進行洗脫實驗，利用DPV法記錄洗脫不同時間后，碳布電極在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl溶液中的電流響應。結果表明，當洗脫時間為10 min時，電流響應增大，當洗脫時間大于10 min時，電流響應開始減小。實驗選擇最佳洗脫的時間為10 min 。

2.3 標準曲線與檢出限

優化實驗條件下，將Cu-Au NPs/PANI/TC/CC修飾電極置于不同濃度四環素溶液中孵育10 min后，放入PBS(0.01 mol/L)中進行DPV掃描，記錄不同濃度四環素分子印跡傳感器在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl溶液中的峰值電流，結果如圖3所示。隨著四環素濃度增大，響應電流逐漸減小，在濃度1.0×10-7～3.0×10-5mol/L范圍內成良好的線性關系，線性方程為：IP=-0.5752lgc+3.6307(IP:10-3A,c:mol/L)，線性相關系數R2=0.9996。信噪比為3時，檢出限為2.57×10-11mol/L。

圖3 不同濃度的四環素在0.01 mol/L PBS中的DPV曲線以及線性擬合圖Fig.3 DPV curve and linear fitting diagram of different concentrations TC in 0.01 mol/L PBS

2.4 抗干擾性和重復性

由于土霉素(OTC)、卡那霉素(KA)、氯霉素(CAP)和四環素(TC)結構相似，因此在四環素溶液中分別加入100倍濃度的上述物質，利用DPV法觀察其電流響應，結果見圖4。從圖中可以看出，加入其它物質對電流響應影響很小，相對標準偏差(RSD)<3.5%,說明抗干擾性良好。

圖4 四環素和不同干擾物混合溶液的DPV曲線(A)以及峰值電流大小柱狀圖(B)Fig.4 DPV curve of mixed solutions of TC and different interference substances(A) and histogram of peak current(B)

將制備的分子印跡傳感器連續5 d利用DPV法測定相同濃度的四環素，DPV的峰值電流分別為0.963、0.954、0.961、0.966、0.949，測定結果的RSD<3%，說明傳感器的重復性良好。

2.5 實際樣品的檢測

取10 mL牛奶(購于超市某品牌)與10 mL無水乙醇混合后，超聲處理20 min，將混合物離心10 min后，過濾，收集濾液，放在冰箱中(4 ℃)備用。

將分子印跡柔性電極置于含樣品的PSB(0.1 mol/L,pH=7.0)中，測定四環素的電流響應值。采用相同的辦法制備加標樣品溶液(牛奶加標濃度為0.02、0.04、0.06 μmol/L)進行回收實驗，并計算回收率和RSD。結果在牛奶樣品中并未檢測出四環素，3個不同濃度下四環素的回收率為97.3%～105%，RSD為2.1%～4.7%。

3 小結

本文用酸化碳布構建了復合納米粒子分子印跡傳感器，用于對四環素的檢測研究。酸化碳布電極更加穩定柔軟，比玻碳電極電流響應更大，納米合金的修飾使碳布電極有更好的電催化特性。四環素的濃度在1.0×10-7～3.0×10-5mol/L范圍內與DPV峰電流成良好的線性關系，檢出限為2.57×10-11mol/L。該傳感器成本低廉，制作簡單，柔軟穩定，靈敏度高，可用于實際樣品中的四環素檢測。