高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法測定富硒碎米薺中的硒形態

林 樾， 陳尚衛， 虞銳鵬， 于 添， 叢 欣， 朱 松*

(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.恩施德源健康科技發展有限公司，湖北恩施 445000)

硒是具有抗氧化防御功能，維持機體內氧化還原平衡的重要微量元素[1,2]。但是如所有必需微量元素一樣，硒不能由人體自主合成，只能由外界攝入來維持其在人體內的正常水平。硒在自然界主要以無機硒和有機硒的形態存在[3]，硒對人體的影響不僅與攝入量有關，更與其化學形態有很大關系[4]。在人體對硒的利用方面，有機硒比無機硒毒性小，有更高的生物利用度，更易于被吸收[5]。我國有72%的地區不同程度缺硒[6]，因此，開發天然的有機硒膳食補充劑至關重要。植物可以有效地將無機硒通過自身代謝作用轉化為不同形態有機硒，因此被認為是天然有機硒合成的生化工廠[7]。植物中的有機硒主要以硒代氨基酸或其衍生物的形態結合于蛋白質[8,9]。人們通過飲食攝入的硒很大一部分來自于富硒植物[10]，有幾百年食用歷史的十字花科植物碎米薺，由于其對硒吸收的良好耐受性，能獲得較高的硒生物積累[11]，有作為有機硒補充劑的巨大潛力。

對于植物樣品中硒形態的分析，如何將樣品中不同形態硒充分地、無轉化地有效提取是解析植物中硒形態準確性的關鍵。水或弱酸直接提取只適用于游離含硒化合物的提取[12]，而對于結合在蛋白上的有機硒，酶解法不但能夠有效地將其釋放，而且溫和的提取條件可以更小程度地減少硒形態之間的轉化。酶解法雖然效率較高，但有機硒的回收率差異較大，這取決于有機硒與蛋白的結合方式及結合位點，使得蛋白酶的選擇和酶解條件的優化非常重要。

目前高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜法(HPLC-HG -AFS)[13]，以及高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(HPLC-ICP-MS)[14]是硒形態分析的兩種常用方法，其中HPLC-ICP-MS具有檢出限低和穩定性好的優點，近年來的應用更為廣泛。秦沖等[15]采用Hamilton PRP X-100色譜柱分離了小麥中的硒，但只分離出了Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、硒代半胱氨酸(SeCys2)和硒代蛋氨酸(SeMet)4種硒形態。Fontanella等[16]分離了經生物強化后的葡萄酒中5種硒形態，但時間長達20 min。Milovanovic等[17]分析了平菇中硒和硫的形態，在酶解處理過程中蛋白酶用量較多導致實驗成本較高，不適用于推廣應用。方勇等[18]應用Alltima C8色譜柱建立了大蒜中5種硒形態分離方法，但其中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)兩種無機硒分離效果不佳。為了分析富硒植物碎米薺中硒形態分布，同時更好地探究其應用價值，本文通過研究酶解提取過程中酶種類、時間、輔助劑添加、酶解次數對硒提取效率的影響，優化條件下，采用HPLC-ICP-MS法對其中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、SeCys2、SeMet 5種硒形態進行分離分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀、電感耦合等離子體質譜儀(美國，珀金埃爾默儀器有限公司)；微波消解儀(美國，CEM公司)；金屬浴磁力攪拌器(德國，IKA公司)；分析天平(梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司)。

Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、MeSeCys標準溶液(中國計量科學研究院)；SeCys2、SeMet標準溶液(北京百靈威科技有限公司)。七氟丁酸(HFBA，阿拉丁試劑有限公司)；KH2PO4、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甲醇(色譜純)(國藥集團化學試劑有限公司)；碎米薺干粉、復合蛋白酶(湖北省恩施德源健康科技發展有限公司)；蛋白酶E(上海穎心實驗室設備有限公司)；中性蛋白酶(杰能科生物工程有限公司)；風味蛋白酶(諾維信生物技術有限公司)；蛋白酶K(默克生命科學技術有限公司)。其它所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 總硒的測定取碎米薺樣品0.1 g(精確到0.0001 g)于消解罐中，加入4 mL HNO3過夜后，加入5 mL超純水，于微波加速反應平臺中消解。微波消解結束后，用超純水將消解液定容稀釋到合適體積，搖勻待測。每個樣品做三次平行，同時做空白實驗。

1.2.2 硒形態的測定取碎米薺樣品0.1 g(精確到0.0001 g)，在溫度40 ℃的條件下，加1 mg SDS，溶于7 mL Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.5)中，先加10 mg風味蛋白酶攪拌4 h，后加10 mg蛋白酶E攪拌4 h。于4 000 r/min離心15 min后取上清液，得到上清液1。沉淀物依照以上的酶解條件再次酶解離心后取上清液，得到上清液2。合并上清液1和2，定容到合適體積，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，使用HPLC-ICP-MS法測定各硒形態含量。實驗流程圖見圖1。

圖1 樣品酶解實驗流程Fig.1 Experimental process of sample enzymolysis

1.2.3 儀器條件色譜條件：采用Thermo Scientific Hypersil GOLD C8色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm，賽默飛世爾科技有限公司);以含0.05%七氟丁酸與3%甲醇的20 mmol/L KH2PO4為流動相，等度洗脫;流速:1.2 mL/min;數據采集時間:7 min;進樣量:15 μL。ICP-MS條件：射頻功率：1 100 W;霧化室氣流:0.91 L/min;輔助氣流速:1.2 L/min;泵速:0.8 r/s;測定模式：動能歧視模式(KED);定量同位素：78Se。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

目前硒形態分析常用的色譜柱是離子交換柱，其中以Hamilton PRP X-100色譜柱居多，但在進行實際樣品的測定時，由于植物樣品在酶法提取時會有較多的酶殘留在提取液中，這些大分子物質會對色譜柱造成一定的損害，導致色譜柱的使用壽命縮短，而C8色譜柱更適合分析大分子類的物質，具有更長的使用壽命。因此本實驗中選擇C8色譜柱進行硒形態的分離。實驗以含3%甲醇的20 mmol/L KH2PO4作為流動相，發現只能分離出Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeCys2，而MeSeCys、SeMet在20 min內均沒有出峰。在流動相中加入七氟丁酸(HFBA)作為離子對試劑，發現不同濃度的七氟丁酸對5種硒的出峰時間也有一定的影響，如圖1所示。當流動相中加入0.1%的七氟丁酸時，5種硒形態均能得到較好的分離，但SeMet出峰時間達到14 min左右。為縮短分離時間，嘗試降低七氟丁酸濃度，當濃度降低為0.05%時，在6 min內可完成5種硒化合物混合標樣的測定，色譜圖如圖3所示。

圖2 不同濃度HFBA時5種硒形態的出峰時間Fig.2 Peak time of five speciations of selenium under HFBA with different concentrations

圖3 5種硒化合物混合標樣的色譜圖(濃度100 μg Se/L)Fig.3 Chromatogram of a mixture of five selenium standards(100 μgSe/L)

2.2 硒形態提取條件優化

2.2.1 蛋白酶的選擇酶法提取是植物硒蛋白中有機硒的有效提取方法。Ni等[19]采用胃蛋白酶處理富硒竹筍，測定其中的有機硒形態及含量。Gergely等[20]在檢測蘑菇中的硒形態時嘗試采用不同蛋白酶聯合水解提取，發現胰酶和蛋白酶ⅩⅣ的組合提取效率最高。不同蛋白酶的提取效果也不盡相同，因此我們考察了不同蛋白酶(復合蛋白酶、蛋白酶E、蛋白酶K、中性蛋白酶、風味蛋白酶)和酶解時間對硒提取效率的影響，結果如圖4。研究表明蛋白酶E的提取效率最高，蛋白酶K的提取效率次高，其余三種酶的提取效率一般。蛋白酶E和蛋白酶K對硒的提取效率好但兩種酶的價格都比較高，而風味蛋白酶的價格較為低廉并且對硒代蛋氨酸的提取有一定的促進作用。另外在8 h時幾種酶的提取效率都有明顯的提高，隨后的時間段變化比較平穩。隨著時間超過12 h硒形態有不穩定的情況出現，推測可能是由于硒形態發生轉化導致。基于以上的考慮，我們選擇蛋白酶E和風味蛋白酶作為后續實驗用酶，酶解時間為8 h。

圖4 不同蛋白酶和酶解時間對硒提取效率的影響Fig.4 The effect of protease types and enzymolysis time on the extraction efficiency of selenium

2.2.2 加酶方式對硒提取率的影響考察了風味蛋白酶，蛋白酶E以及兩種酶復合提取對碎米薺中硒提取率的影響。復合酶提取采用三種方式：方法(1)：先加10 mg蛋白酶E攪拌4 h后，再加10 mg風味蛋白酶攪拌4 h；方法(2)：先加入10 mg風味蛋白酶攪拌4 h后，再加入10 mg蛋白酶E攪拌4 h；方法(3)：同時加入10 mg蛋白酶E，10 mg風味蛋白酶攪拌8 h。結果如圖5，發現復合酶比單酶有更好的提取效率。其中，先加風味蛋白酶后，再加蛋白酶E的方法提取效率最高，可能由于隨著時間的增加，酶的活性有所下降，及時添加酶保證了體系中酶的濃度。同時我們發現兩種酶的加入先后順序不同也會對提取效率造成影響。在酶解過程中溶液體系的pH值不斷下降，蛋白酶E的最適pH值在7.5左右，而風味蛋白酶的最適pH值范圍在6～8之間，先加風味蛋白酶后加蛋白酶E的順序，使兩種酶恰好能在較合適的pH值條件下進行反應，從而達到了更好的酶解提取效果。

圖5 加酶方式對硒提取效率的影響Fig.5 The effect of the way of adding enzyme on the extraction efficiency of selenium

2.2.3 輔助酶解劑添加對硒提取率的影響SDS可以使蛋白質變性，形成離子對溶解不溶性蛋白質，從而能夠更徹底地水解蛋白質，將結合態的有機硒從蛋白質中酶解分離出來，達到更高的有機硒提取效率[21]。加入SDS輔助后對提取效率有一定的促進作用，可使碎米薺中硒提取率上升10%左右。

2.2.4 酶解次數對硒提取率的影響第一次酶解后硒提取率只達到了60%左右，延長時間又會導致硒形態的轉化。實驗采取多次酶解法，將第一次酶解后的殘渣用同樣的方法再一次酶解來提取其中殘余的硒，第二次酶解后提取率明顯升高，而在第三次酶解時硒的提取率變化較小。為了節約提取時間，最終采用兩次酶解法來提取碎米薺中不同形態的硒。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線與檢出限配制0.5、1.0、5.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μgSe/L的硒標準混合溶液，在優化后的實驗條件下進行分析，以硒的濃度(x)為橫坐標，色譜峰的面積(y)為縱坐標，結果表明5種形態硒線性關系良好，相關系數(R2)均大于0.999。以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計算該方法的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，5種形態硒的LOD在0.08～0.25 μgSe/L之間，LOQ在0.25～0.54 μgSe/L之間。5種形態硒的回歸方程、線性范圍及LOD和LOQ見表1。

表1 5種形態硒的線性關系及檢出限Table 1 Linear relationship and limits of detection for five speciations of selenium

2.3.2 準確度和精密度稱取6份富硒碎米薺樣品，采用文中酶法提取方法處理后，按優化色譜條件分析，計算精密度(RSD)。由表2可知，RSD小于5%，說明該方法精密度良好，能滿足樣品檢測要求。將樣品酶法提取預處理后每隔2 h進行測試，其RSD小于5%，說明樣品在10 h內穩定性良好。重復制備樣品6次進行測試，RSD小于5%，說明該方法重復性良好。

為驗證方法的精密度，選取一種碎米薺樣品，分別添加100、300、500 μgSe/mL 3個濃度的硒混合標準溶液進行加標回收實驗，每個濃度做3個平行。5種形態硒加標回收率在85.8%～106.3%范圍，RSD小于3.58%，結果見表2。

表2 5種形態硒的回收率、精密度、穩定性實驗結果Table 2 Repeatability,stability and recovery of five speciations of selenium

2.4 實際樣品測定

運用本實驗建立的方法，將4種碎米薺進行硒形態分析，結果如表3。發現不同碎米薺樣品中硒形態分布也不完全相同，其中主要形態為以SeCys2和SeMet為主的有機硒，兩種有機硒的含量高達52.23%～70.21%。酶法處理后硒的提取率為81.05%～89.21%。圖6為4種碎米薺形態分析的液相色譜圖。碎米薺樣品中還有少量的未知形態硒的色譜峰，還有待于進一步通過質譜進行鑒定。

表3 碎米薺中硒形態分析結果(mg/kg)Table 3 Analysis results of selenium speciation in Cardamine violifolia(mg/kg)

圖6 4種碎米薺硒形態分析的色譜圖Fig.6 Chromatograms of selenium speciation for 4 kinds of Cardamine violifolia

3 結論

本研究通過酶法提取，采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法分析富硒碎米薺中硒形態，并進行了方法學驗證。該方法硒提取效率較高，成本較低，優化條件下可在6 min內完成5種不同形態硒的檢測。采用該方法對碎米薺中硒形態分析，發現其中硒以硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸等有機硒為主，同時含有少量無機硒和未知硒化合物，對于其中未知硒化合物，還有待于進一步通過質譜手段進行鑒定。