肝損傷代謝組學模型的構建及其中藥提取物水飛薊賓治療的評價

錢婷婷, 朱旭婷， 盧吟秋， 李依桐， 喻春皓， 謝洪平*

(1．淮陰工學院制藥工程系，江蘇淮安,223000;2．蘇州大學醫學部藥學院，江蘇蘇州,215123;3．江南大學附屬醫院，江蘇無錫，214000)

代謝組學在肝臟疾病研究中獲得了一定的應用，包括診斷、治療和機制研究[1]。由于中藥及其提取物在肝功能調節和肝病治療中具有獨特療效，因此基于代謝組學的研究被關注[2 - 8]，包括復方中藥對肝纖維化[2]和肝損傷的干預[3]、單味中藥對肝損傷的干預和保護[4]、單味中藥提取物對肝功能的調節[5 - 7]和肝損傷的治療[6,8]。在代謝組學模型中均能夠發現中藥可以阻止肝功能的失調和肝損傷治療的回調，因此，代謝組學可以用于中藥療效的評價。

水飛薊賓(Silybin,SIL)為單味中藥提取物，屬黃酮木脂素類化合物[9]，臨床上常用于急慢性肝炎、肝中毒和肝硬化的治療，同時它也有肝功能保護和調節作用[7]。對于代謝組學的研究，包括基于核磁共振代謝譜的降低脂質合成[5]，利用氣相色譜-質譜(GC-MS)作為代謝譜的肝損傷預防和治療[6]，以及基于液相色譜-質譜(LC-MS)檢測尿液樣本作為代謝譜的肝損傷治療[8]。眾所周知，代謝組學模型的準確性主要取決于代謝譜的準確表達和多變量分析方法的正確選擇兩個因素[10,11]。為了讓代謝譜盡可能準確地表征因藥物毒性導致的偏離正常生理狀態(穩態)，或者因藥物治療導致的回調至正常生理狀態，也主要由兩方面的因素決定：第一，檢測方法能夠讓代謝樣本中的“所有組分”盡可能地出現“選擇性”的檢測信號，如大量的分離色譜峰，這是正確表征組分含量變化的前提，正是基于此，LC-MS比GC-MS更為廣泛地應用于代謝物檢測；第二，代謝物譜中包括了內源性和外源性代謝物信號，而內源性代謝物譜偏離穩態或者回調至穩態才是代謝組學模型的基礎，因此準確表達藥物毒性或者藥物治療的代謝譜只能包含內源性代謝物信號和穩定的不變信號。然而，LC-MS檢測信號中，必須消除外源性代謝物信號和色譜基線漂移[10,11]，否則相對于正常對照組，模型組所包含的這些差異性信號將導致模型動物組偏離正常組的程度被擴大化，即模型組的毒性被放大；在對模型組動物進行治療時，向正常組的回調程度又會被弱化，即藥效被弱化，而更多的是表現為“既偏離模型組又偏離正常組”[8]。事實上，僅僅從模式識別來看，當預測樣本的分類行為與校正樣本不一致時，表明模式識別模型是不正確的。當然，基于此的代謝組學模型對藥物毒性或者藥效的預測也就是不可靠的，甚至是錯誤的。而中藥的組分含量普遍較低，決定了療效的溫和性以及毒性的不顯著性，代謝組學模型中的病理或者毒理差異將會更小，外源性代謝物信號和色譜基線漂移的影響將更為顯著。

本文擬用LC-MS為檢測技術，以尿液為檢測樣本，利用本課題組建立的外源性代謝物信號的消除方法[10]和基線漂移校正方法[11]，獲取內源性代謝物譜，以此表達代謝輪廓，建立主成分分析(PCA)代謝組學模型，擬發現代謝標記物，并以此標記物為基礎建立偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)代謝組學模型。對水飛薊賓組在治療前和治療后的代謝組學行為進行研究，擬實現水飛薊賓治療肝損傷療效的準確評價。建立的中藥治療評價方法將具有非損傷性、靈敏性、方便性和持續性的顯著特點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀(Acquity UPLC)-三重四極桿質譜儀(Quattro Premie XE)，美國Waters公司。低溫高速離心機(Avanti J-26XP)，美國貝克曼庫爾特有限公司。高速離心機(TGL-16B)，上海安亭科學儀器公司。

甲醇、乙腈和甲酸購自Merck公司。

1.2 動物實驗與檢測樣本獲取

取健康雄性SD大鼠15只(清潔級，體重150±20 g)由蘇州大學實驗動物中心提供。每天置于控制光照12 h、黑暗12 h、室溫25±2 ℃、相對濕度40%～60%條件下，自由攝食和飲水。實驗前適應性飼養一周，再隨機分為對照組(Con組，n=5)、模型組(Mod組，n=5)和水飛薊賓組(Sil組，n=5)，單只動物單個代謝籠飼養。

在0～24 h，模型組和水飛薊賓組，用20%的四氯化碳橄欖油溶液，按2 mL/kg單劑量灌胃[12]；對照組給予相同體積的橄欖油溶液。24 h后即得肝損傷動物模型。在24～48 h，水飛薊賓組按治療劑量100 mg/kg(50 mg/mL水溶液)，分上午和下午2次灌胃給藥；模型組和對照組給予相同體積的蒸餾水。分別收集每只動物在0～24 h和24～48 h的尿液，每只接尿器中加入1.0 mL 1%的疊氮鈉溶液作為防腐劑。

在采血前12 h，實驗大鼠禁食。實驗后，腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，下腔靜脈采血，在不加抗凝劑的EP管中靜置1 h后，3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液即血清，置于-20 ℃冰箱保存，用于生化指標測定。同時將大鼠肝臟組織去除邊緣5 mm后，剪切相同部位一小塊，置于10%甲醛溶液的容器中固定24 h以上，送蘇州大學病理實驗室制作病理切片，待顯微鏡檢測。

1.3 尿液樣本預處理與檢測

預處理：同一尿液樣本分別取1.4 mL于2只EP管中，在13 000 r/min、4 ℃離心10 min，各取上清液1.0 mL合并入15 mL離心管中，加入6.0 mL的甲醇，渦旋，振搖，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液分裝入1.5 mL EP管中，置-80 ℃冰箱保存待測。超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)檢測前，將樣品從-80 ℃冰箱中取出。加體積比1∶1 的甲醇，渦旋混勻后13 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，濾液于13 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液轉入進樣小瓶，即刻檢測。

UPLC-MS檢測：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm；Waters公司)，柱溫30 ℃；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，流速0.2 mL/min；進樣量1 μL。梯度程序以流動相A表示為：0→1→3→7→11→12→14 min對應為99%A→99%A→85%A→50%A→5%A→99%A→99%A。每10個樣本間穿插一個質控樣本，以監測儀器的穩定性。離子源為電噴霧離子源，正離子模式檢測；脫溶劑氣溫度為350 ℃，脫溶劑氣流速1 000 L/h；毛細管電壓為2 000 V；錐孔電壓為30 V。每0.5 s采集一次譜圖，質量掃描范圍m/z50～1 000。

2 結果與討論

2.1 消除色譜基線漂移

代謝譜準確表達的首要前提是代謝樣本中各組分的含量變化要盡可能地準確表達，這就要求檢測時各組分色譜峰要盡可能地分離，為此在選定色譜柱及流動相后，采用梯度洗脫，以保證盡可能多地分離出色譜峰，嚴重的基線漂移也就不可避免，見圖1A。眾所周知，基線漂移不但有等性的，還有非等性的。而這些非等性的漂移基線是隨信號的增強而增強，見圖1B。采取常用的擬合等性漂移基線去扣除信號峰中包含的基線漂移，對于高含量組分準確度的影響是可以忽略不計的，但是對于代謝組學中所關注的內源性代謝物信號的增加或者降低，通常這種變化的程度是較弱的，特別是中藥毒性或者藥效引起的變化會是更弱，因此組分峰中基線漂移的準確消除就顯得特別重要[11]。我們研究組基于LC-MS中MS的高度選擇性(即近似于線狀的質譜峰)提出了一種確定真實色譜基線并消除基線漂移的方法[11]。其基本思想和方法為：在LC-MS/MS的二維數據矩陣中，每一個m/z均對應一個色譜矢量，在所檢測的m/z范圍內，由于MS的高度選擇性，必然導致了大量的被檢的m/z處并沒有碎片離子的質譜信號，這些m/z處的色譜矢量即就是色譜基線，它是全部保留時間范圍內的色譜基線，即真實的色譜基線；以信噪比(S/N)≥3為標準，對一個色譜矢量的所有元素進行比較，當均為噪聲時，該色譜矢量即為相應m/z下的色譜基線矢量；對確定的所有m/z下的色譜基線取平均，作為該檢測樣本的色譜基線，以實現基線扣除。對于Sil組，以此方法獲得了所有樣本的總離子流色譜的平均基線，結果參見圖1B。可以發現，基線漂移的非等性特別嚴重，將會導致代謝組學模型的嚴重偏離。以此基線，扣除基線漂移，結果參見圖1A。可以發現，色譜的基本形狀沒有改變，但是相對高度發生了變化，這正是非等性所引起的；同時，基線的漂移也被有效消除。

2.2 消除外源性代謝物信號

相對穩定的內源性代謝物譜是機體正常生理狀態的反映，當發生病理性或者毒理性變化時，它將發生偏離，這就是代謝組學模型的基礎。然而，機體的代謝樣本，比如常用的尿液和血液，既有內源性代謝物，又有外源性代謝物，如常見的藥物代謝物，多出來的外源性代謝物的檢測信號明顯降低了代謝組學模型的準確度。對于本文中大鼠尿液樣本，檢測結果參見圖2。可以發現，與對照組比較，給藥組由于藥物代謝物的存在，導致多出現了色譜峰(圖2A)。以6～9 min為例，在其放大圖(圖2A內插圖)中可明顯地觀察到，給藥組中多出了保留時間約為6.9、7.6、7.8和8.5 min的4個外源性代謝組分峰(圖中箭頭標注)。與對照組比較，給藥組中內源性代謝物信號的增強或者減弱程度，明顯小于多出來的外源性代謝物信號強度，它將嚴重削弱內源性代謝物信號的變化對代謝組學模型的貢獻率，從而導致代謝組學模型對毒性和藥效的準確表征和靈敏表征。對于中藥的弱毒和弱效，這種影響將更為嚴重，甚至代謝組學模型將可能得出錯誤的結論。

據此，基于組分間質譜信號正交性，我們研究組建立了基于質譜的正交投影(MSOP)方法，消除給藥樣本數據中的外源性代謝物檢測信號[10]。該方法的基本思想和方法為[10]：在LC-MS矩陣數據中，對于同一保留時間的質譜矢量，與對照組比較，給藥樣本中包括了兩類碎片離子。第1種，m/z與對照組相同，但質譜強度可以相同，也可以不同，這些碎片離子就是“內源性代謝物組分質譜”，它們僅僅是表征了濃度的變化；第2種，比對照組多出的碎片離子，即就是外源性代謝物組分的質譜。此時，當用對照樣本的質譜矢量構建的MSOP去投影給藥樣本的同一保留時間的質譜矢量時，給藥樣本中與對照樣本相同組分(內源性代謝物)的質譜就被消除，殘差矢量即為給藥樣本中多出現的差異性組分的信號，即外源性代謝物的質譜。不同保留時間重復該正交投影，將獲得給藥樣本檢測信號矩陣中包含的外源性代謝物信號矩陣。通過信號扣除，即可獲得給藥樣本的內源性代謝物信號矩陣。對于本文的尿液樣本，從檢測信號中用MSOP法消除外源性代謝物信號，結果參見圖2B。同樣也以6～9 min為例，在其放大圖(圖2B內插圖)中可以發現，與對照組比較，給藥組中明顯多出來的那4個外源性代謝組分峰已經被消除，同時所有的組分能夠基本對應，僅僅表現出的是“量的多與少”，這也正是代謝組學所關注的組分。從整個色譜(圖2B)來看，也是反映的這種“量的多與少”的特征，由此說明給藥樣本中的藥物代謝物信號已經被有效消除。

圖2 消除外源性代謝物前(A)和后(B)的總離子流平均色譜圖Fig.2 Average total ion chromatograms before(A) and after(B) eliminating exogenous metabolitesLine a:Group Sil;Line b:Group Con;Inset:partially enlarged.

2.3 代謝組學模型與治療評價

對于獲得的內源性代謝物譜，常用PCA和PLS建立代謝模型。PLS是有監督的分類，適用于變量對分類貢獻明確的情況，如以標記物作為變量。而無監督的分類方法PCA適用于變量對分類貢獻不明確的情況，以此進行模型分類，并以此模型去發現標記物[10,11]。據此，我們以獲得的內源性代謝物總離子流色譜為識別變化，經濃度歸一化處理后，利用PCA方法，建立了四氯化碳肝損傷代謝組學模型(圖3)。從圖3A可以發現，與對照組比較，模型組發生了明顯偏離，它們被分為了兩類模式識別樣本，表明四氯化碳肝損傷導致了內源性代謝物譜偏離正常的生理狀態，表現出了明顯的肝損傷病理特征。在正常對照組中，其中一個樣本被分類到了模型組中，其統計行為與正常組不一致，應該作為奇異樣本。事實上，PCA模型的分類與肝組織顯微成像特征是一致的。對照組(圖3B)肝細胞肝小葉和肝細胞核結構完整清晰，肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀規則有序排列；四氯化碳造模后(圖3C)肝細胞出現了較大程度的脂肪性病變，肝細胞腫脹呈圓形，呈現空泡樣變性，細胞核體積增大被擠向一側，胞漿內充滿大小不等的脂滴，中央靜脈及匯管區大量炎癥細胞浸潤，說明四氯化碳致大鼠肝組織損傷造模成功，這與代謝組學PCA模型的結論一致。與血清生化指標的結論也相符合。在四氯化碳造模后，與對照組比較，谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)酶活性有明顯升高，分別從33.13±9.13升高到86.90±36.76 IU/L，以及從48.95±12.18升高到145.22±32.02 IU/L，均表現出了明顯的統計學差異。上述結果表明，獲得的內源性代謝物譜能夠準確地表征機體的毒理狀態，據此建立了準確的肝損傷代謝組學模型。

圖3 水飛薊賓治療肝損傷的基于PCA的代謝組學模型(A)及其Con組(B)、Mol組(C)和治療后的Sil組(D)的肝組織顯微圖像:Con組；：Mol組；治療前(Ο)的后(*)的Sil組Fig.3 Silybin-treated PCA based metabonomics model of liver injury(A) and their microscopic images of liver tissue for Groups Con(B),Mol(C),and treated Sil(D)?:Group Con;△:Group Model(Mol);Groups Sil before(Ο) and after(*) treating with silybin.

對于水飛薊賓治療的同一組動物，為了與臨床治療一致，也首先四氯化碳造模，結果見圖3A中給藥組治療前的樣本，這些樣本與模型組的分類一致，表明給藥組治療前的內源性代謝物譜特征與模型組一致。當給予水飛薊賓治療之后，樣本分類與正常對照組重疊，表明經過治療后的內源性代謝物譜特征與正常對照組一致，給藥組的肝損傷回調到了正常對照組，說明肝損傷得到了恢復。肝組織顯微成像(圖3D)也證實了此結論。可以發現，四氯化碳造模導致的肝細胞脂肪性、形態學以及炎性病變均消失，與對照組沒有顯性差異(圖3B)。從血清生化指標可見，與模型組比較，ALT及AST酶活性有一定回調，分別從86.90±36.76 IU/L降低到74.99±24.98 IU/L，以及從145.22±32.02 IU/L，降低到88.08±36.25IU/L，但是均未回調至正常對照組的水平。這種回調是具有統計學差異的，也說明給藥組模型動物的肝損傷獲得了一定療效。眾所周知，“非損傷性的”血清生化檢測的敏感性明顯弱于“損傷性的”肝組織顯微成像，也正是如此，組織活檢通常作為臨床診療的金標準。而PCA代謝組學與活檢結論是一致的，這也從此實例證實了通常所認為的“代謝組學具有高靈敏度”的結論。這種療效評價的靈敏性對于中藥“溫和”療效的評價尤其重要。說明代謝組學還具有了血清生化檢測作為常規檢測的顯著特征“方便性、持續性”。這也是組織活檢不能作為常規檢測的根本原因。綜上可知，內源性代謝物譜也能夠準確地表征治療過程的病理狀態，構建的代謝組學模型評價水飛薊賓治療肝損傷療效的方法具有非損傷性、準確性、靈敏性和方便持續性的顯著特點。

經過PCA分析后，獲得了分類模型的載荷矩陣，其中的每一個載荷矢量表征了相應的保留時間點對應的內源性代謝物的色譜組分(即質譜矢量)對分類的貢獻，也就是對藥效或者毒性表達的貢獻，該矢量模的數值越大貢獻就越大，據此可計算得到每一個色譜組分的貢獻率。以貢獻率值≥0.15%為標準，從1 667個色譜組分中找出了119個，作為高貢獻組分(圖4A)，這也僅僅占到7.1%的色譜組分數，其它92.9%的色譜組分作為低貢獻組分。以高貢獻組分作為標記物，建立了有監督的模式識別模型，即PLS-DA代謝組學模型(圖4B)。可以發現，在PCA模型中的結論同樣也能夠在此模型中呈現，說明以極少的標記物是可以實現對中藥療效的靈敏評價。

圖4 色譜組分對分類的貢獻率(A)及其基于標記物的PLS -DA代謝組學模型(B)Fig.4 Contribution ratios of chromatographic components to the classification(A) and the marker basedPLS-DA metabonomics model(B) ?:Group Con;△:Group Mol;Groups Sil before(Ο) and after(*) treating with silybin.

3 結論

利用四氯化碳致肝損傷動物模型，以尿液為樣本，獲得了色譜-質譜二維矩陣數據。利用基于質譜選擇性和正交性構建的色譜基線漂移和外源性代謝物信號的消除方法，獲得了內源性代謝物總離子流色譜，據此建立了肝損傷的代謝組學模型。模型表達的四氯化碳致毒特征與組織細胞顯微特征和血清學指標一致。對于肝損傷的模型動物，當給予中藥提取物水飛薊賓治療時，肝損傷具有明顯的回調趨勢，治療前的代謝組學分類特征與模型組一致，治療后與正常對照組一致，均與肝組織顯微成像特征一致。然而，血清學指標雖然也明顯回調，但還未回調到正常狀態。由此表明，代謝組學肝損傷療效評價的靈敏性與“損傷性的”作為“金標準”的組織顯微成像一致，而明顯高于常規的血清學檢測。因此，本文獲得的內源性代謝物譜準確地表征了致毒過程的毒理狀態和治療過程的病理狀態。建立的代謝組學模型實現了非損傷、準確、靈敏、方便持續的中藥治療評價。