苯丙酮尿癥患兒苯丙氨酸羥化酶基因外顯子7突變特點(diǎn)及臨床研究

周怡，闕敏，王新靜

(安徽省婦女兒童保健中心新生兒疾病篩查科，安徽 合肥 230061)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)為苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)基因突變導(dǎo)致常染色體隱性遺傳病，多誘使肝臟PAH活性缺失或者降低，在我國發(fā)病率約為1/11 000[1]。PKU會嚴(yán)重影響兒童腦組織發(fā)育，未接受及時(shí)治療會導(dǎo)致患兒出現(xiàn)語言、智力及運(yùn)動功能障礙，且不可逆[2]。PKU按照血液中苯丙氨酸水平可以分為經(jīng)典型、中間型以及輕型，其中近90%為經(jīng)典型。不同國家、地區(qū)基因突變存在差異，因此不同地區(qū)基因突變特點(diǎn)存在差異[3]。PAH為發(fā)揮催化作用四聚體，可以將機(jī)體肝臟苯丙氨酸催化為酪氨酸，PAH基因存在12個(gè)內(nèi)含子及13個(gè)外顯子編碼，其中外顯子7與PAH酶活性功能關(guān)系密切[4]。因此，PAH基因外顯子7突變種類、分布及特點(diǎn)在PKU患兒診斷發(fā)揮重要作用，也可以為患兒PAH基因突變具體機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。本研究通過采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand Cconformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products，PCR-SSCP)及序列技術(shù)對PKU患兒進(jìn)行檢測，旨在明確PAH基因外顯子7突變特點(diǎn)及其與臨床的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2020年12月安徽省婦女兒童保健中心中心診治的87例PKU患兒為研究對象。其中男性49例，女性38例；年齡0.7～7歲，平均(4.13±1.64)歲；依據(jù)苯丙氨酸水平分型：輕型(<600 μmol/L)8例，中間型(600～1 200 μmol/L)13例，經(jīng)典型(>1 200 μmol/L)66例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)參照《高苯丙氨酸血癥診治共識》(2014年)中對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行診斷；(2)均接受了血二氫蝶啶還原酶、尿蝶呤譜、四氫生物蝶呤負(fù)荷試驗(yàn)；(3)初診時(shí)苯丙氨酸水平超過120 μmol/L；(4)年齡0.7～7歲；(5)患兒研究參與獲得其家屬知情同意，研究進(jìn)行符合《赫爾辛基宣言》中倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)酪氨酸血癥、四氫生物蝶呤缺乏癥、一過性高苯丙氨酸血癥患者；(2)近期服用影響苯丙氨酸藥物；(3)在入組前已經(jīng)行對癥治療者；(4)存在心臟、肝腎、肺部等機(jī)體重要器官功能異常者。

1.2 方法

收集3 mL靜脈全血，置于抗凝試管中待測。(1)DNA提取：應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit(德國Qiagen公司)抽提，DNA抽提濃度可以通過增加洗脫次數(shù)并延長高溫孵育時(shí)間提高，獲得基因DNA用1%瓊脂糖電泳予以鑒定，將其置于-20 ℃保存待測。(2)PCR擴(kuò)增：采用C1000 Touch型號PCR儀(美國Bio-Rad公司)完成。反應(yīng)體系：1×緩沖液、dNTP、正向引物、反向引物、Taq酶、擴(kuò)增反應(yīng)模板、雙蒸水體積分別為3、1、1、1、1、1、17 μL。PCR反應(yīng)測定應(yīng)用；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min→95 ℃變性45 s→60 ℃退火60 s→72 ℃變性45 s，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，隨后將其溫度降至4 ℃。應(yīng)用1%瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于-80 ℃冰箱保存待測。(3)DNA序列以及突變位點(diǎn)測定：應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測序法進(jìn)行檢測，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司負(fù)責(zé)樣品純化以及序列檢測，測序獲得PAH基因DNA結(jié)果需要與基因庫中對應(yīng)結(jié)果予以比對，并依據(jù)基因庫中結(jié)果確定外顯子7突變情況。(4)基因型與PKU表型分析：依據(jù)Guldberg等[6]提出評分方式評估突變基因人為值(assigning value，AV)，其值與突變基因性質(zhì)關(guān)系密切，AV值為1時(shí)表示存在突變，而殘余酶活性范圍低于10%、10%～30%、30%～70%及70%以上AV值分別賦分1、2、4、8分，最后將突變等位基因評分AV數(shù)值相加。依據(jù)AV數(shù)值之和預(yù)測患兒PKU表型，其中AV值之和為2、3～8及9以上分別表示為經(jīng)典型、中間型及輕型PKU。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。計(jì)數(shù)資料[n(%)]表示；基因型與PKU表型的預(yù)測價(jià)值應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 患兒PAH基因外顯子7位點(diǎn)突變情況

87例患兒一共存在174個(gè)等位基因，最終檢出6種PAH基因外顯子7位點(diǎn)突變，其基因型分別為R243Q、IVS7+2T-A、R241C、G247R、L255S、G247V。見圖1。

2.2 患兒PAH基因外顯子7位點(diǎn)突變頻率

87例患兒中，40例外顯子7位點(diǎn)突變中檢出1種基因突變，其中R243Q基因突變32例，IVS7+2T-A基因突變6例，R241C基因突變2例；4例中檢出2種基因突變，其中R243Q/IVS7+2T-A基因突變1例，R241C/G247V基因突變1例，G247R/L255S基因突變2例。R243Q、IVS7+2T-A、R241C、G247R、L255S、G247V基因突變頻率分別為18.97%、4.02%、1.72%、1.15%、1.15%、0.57%。見表1。

表1 患兒PAH基因外顯子7位點(diǎn)突變頻率[n(%)]

2.3 患兒PAH基因外顯子7位點(diǎn)突變情況與表型的關(guān)系

經(jīng)典型PKU患兒檢出6種突變，中間型PKU檢出R243Q、IVS7+2T-A、R241C三種突變，而輕型PKU僅檢出R243Q突變。見表2。

表2 患兒PAH基因外顯子7位點(diǎn)突變情況與表型的關(guān)系[n(%)]

2.4 患兒基因型-表型預(yù)測分析

應(yīng)用外顯子7位點(diǎn)突變情況預(yù)測患兒PKU表型，經(jīng)典型、中間型及輕型PKU預(yù)測與臨床診斷一致性較高，Kappa值分別為0.818、0.781、0.935。見表3。

表3 患兒基因型-表型預(yù)測分析

3 討論

PKU主要由PAH基因突變所致，PAH基因主要由位于編碼位置13個(gè)外顯子及位于非編碼位置12個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄mRNA及翻譯氨基酸作用。PAH基因亞基變化均會導(dǎo)致酶功能及結(jié)構(gòu)變化，對應(yīng)編碼位置基因變化會進(jìn)一步導(dǎo)致PAH功能降低或者缺失，進(jìn)而使機(jī)體出現(xiàn)相應(yīng)臨床表現(xiàn)[7-8]。PAH基因外顯子7主要存在于PAH酶催化區(qū)域，該區(qū)域存在氨基酸殘基情況與活性位點(diǎn)關(guān)系密切，氨基酸堿基變化誘使PAH酶活性受到影響。因此，PAH基因外顯子7是PKU患者PAH基因突變重要分析部分[9-10]。

本研究在PKU患兒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)6種PAH基因外顯子7突變，分別為R243Q、IVS7+2T-A、R241C、G247R、L255S、G247V，6種基因突變頻率分別為18.97%、4.02%、1.72%、1.15%、1.15%、0.57%。有研究[11]顯示，84例患兒中共鑒定出159個(gè)PAH突變等位基因，包括100個(gè)錯(cuò)義突變、28個(gè)剪切突變、24個(gè)無義突變和7個(gè)缺失突變，外顯子7突變頻率最高(32.08%)，其中p.R243Q的突變頻率最高，占全部突變的20.13%，與本研究結(jié)果一致。另一研究[12]顯示，PAH基因中最常見遺傳變異為c.1066-11G>A和c.143t>c，與任何單個(gè)外顯子相比，外顯子7攜帶遺傳變異最多，3例患者PAH基因第7、11外顯子c.727c>T/c.1066-11g>A雜合。本研究結(jié)果顯示，大部分患兒均檢出1種基因突變，且主要為R243Q基因突變，少部分患兒可以檢出2種基因突變。國內(nèi)研究者[13]也發(fā)現(xiàn)，PKU患兒中檢出基因突變也為1種，且主要為第7號外顯子，但是也發(fā)現(xiàn)1例典型病例出現(xiàn)2個(gè)雜合基因突變，主要為p.S70del(缺失突變)c. 208-210delTCT(缺失突變)，與本研究中相關(guān)結(jié)果相似。另研究[14]者發(fā)現(xiàn)，70例PKU患兒中大部分為復(fù)合雜合變異，僅有3例為純合變異，原因可能是其研究中除檢測外顯子7號位點(diǎn)突變外，還檢測了其他各種外顯子以及內(nèi)含子位點(diǎn)突變，但是本研究中僅檢測了外顯子7位點(diǎn)基因突變。對應(yīng)基因型中變異位點(diǎn)相對溫和位點(diǎn)即剩余酶活性高位點(diǎn)在基因突變中發(fā)揮主導(dǎo)作用，即其在基因型表型形成發(fā)揮決定作用[15]。經(jīng)典型PKU患兒檢出6種突變，中間型PKU檢出R243Q、IVS7+2T-A、R241C三種突變，而輕型PKU僅檢出R243Q突變，顯示PKU患兒PAH基因突變基因型與患者臨床表現(xiàn)存在相關(guān)性。本研究應(yīng)用外顯子7位點(diǎn)突變情況預(yù)測患兒PKU表型，經(jīng)典型、中間型以及輕型PKU預(yù)測與臨床診斷一致性較高，Kappa值分別為0.818、0.781、0.935，顯示PAH基因型與臨床診斷表型存在相關(guān)性，可用于患者臨床表型診斷。Wang等[16]研究中，35例患兒中檢出70個(gè)等位基因中鑒定出61個(gè)突變，頻率為87.14%，最常見突變?yōu)镽243Q(26.23%)、R241C(9.84%)和V399V(8.20%)，生化表型預(yù)測與臨床表型一致性為81.25%，其中經(jīng)典PKU的一致性最高(87.50%)。

綜上，PKU患兒PAH基因外顯子7位點(diǎn)突變有6種類型，其突變類型主要為R243Q，患兒臨床表型與突變基因型存在相關(guān)性，突變基因型用于預(yù)測臨床表型價(jià)值優(yōu)異，可以為其后患兒診斷以及預(yù)后評價(jià)提供參考依據(jù)。但是基因突變?nèi)菀资芊N族、地區(qū)等諸多因素影響，因此后期需要進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本量，明確不同種族以及地區(qū)對PKU患兒PAH基因突變影響。