傳統染色體核型分析及CMA在產前診斷中的應用價值比較

張金花，余珍，王麗霞，李妤

(烏魯木齊市婦幼保健院產前診斷中心，新疆 烏魯木齊 833000)

染色體異常是導致胎兒流產、新生兒先天性畸形的常見因素之一，在孕期對孕婦行染色體檢查可有效篩查染色體異常疾病，降低先天性畸形患兒的出生率[1]。染色體核型分析是臨床遺傳學病因診斷的“金標準”，在染色體畸變診斷方面具有重要的意義[2]。但部分研究[3]發現，染色體核型分析在識別微小缺失或重復、不平衡易位方面準確率較低。染色體微陣列分析(chromo-some microarray analysis，CMA)是一種新型的分子核型分析技術，可在全基因組范圍內識別微缺失和微重復，對染色體拷貝數變異(copy numbervariations，CNVs)具有較高的診斷準確率，可為臨床遺傳學病因診斷提供更高的染色體異變信息。但也有學者[4]認為，CMA結果分析復雜，對平衡易位、<30%嵌合體等染色體異變檢出率較低，臨床無法完全替代染色體核型分析。本研究擬評估傳統染色體核型分析和CMA在產前診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月至2020年12月于烏魯木齊市婦幼保健院產前診斷中心453例接受傳統染色體核型分析和CMA的孕婦為研究對象。納入標準：(1)滿足以下任意一項診斷指征[5]：①年齡≥35歲；②產前超聲檢查提示超聲異常，包括胎兒發育異常、可疑畸形、羊水過多或過少等；③存在不良孕產史；④夫妻一方存在遺傳病家族史；⑤產前血清學篩查高風險，包括唐篩高風險、無創篩查結果異常等；(2)孕婦均為單胎妊娠；(3)所有孕婦均知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：(1)產前檢查存在致死性超聲結構異常；(2)存在羊膜腔穿刺禁忌癥。其中，孕婦年齡為22～42歲；孕周為15～34周；產前檢查具有單項診斷指征異常325例，兩項及以上診斷指征異常128例。研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析 (1)羊水細胞培養：B超探頭引導下，經腹行羊膜腔穿刺術，常規抽取羊水30 mL；1 500 rpm離心10 min，20 mL離心棄上清后置于不同羊水培養基中，于不同二氧化碳細胞培養箱中培養5～7 d，培養溫度為37 ℃，二氧化碳濃度為5%；收獲前加入10 μL秋水仙堿，固定、制片后行常規G顯帶染色體核型分析。(2)染色體核型分析：參考2016年人類細胞遺傳學國際命名體系(ISCN2016)進行核型分析[6]，使用全自動核型掃描儀(Leica SL120型，德國徠卡微系統有限公司)掃描100個分裂相，計數20個核型，分析5個，異常核型及嵌合體加倍計數至50個。

1.2.2 CMA (1)全基因組DNA提取：取孕婦羊水10 mL，使用DNA提取試劑盒(QIAamp?DNA Blood Mini Kit)提取基因組DNA，-20 ℃下保藏待測。(2)CMA：取5 μL全基因組DNA，NspⅠ酶消化，消化后補齊產物末端，連接共同引物；擴增樣本DNA至150～2000 bp，磁珠法進行純化；純化后的產物經片段化酶片段化并標記；采用全基因組Affymetrix Cytoscan 750K Array芯片(美國Affymetrix公司)用于檢測全基因組中有臨床意義的染色體微缺失/微重復、染色體亞端粒缺失綜合征等異常的CNVs和雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)；實驗流程按照Affymetrix公司提供的實驗操作流程進行，數據經ChAS軟件(美國Thermo公司)進行處理，檢測結果與DECIPHER數據庫、DGV數據庫、Genes-NCBI數據庫和OMIM數據庫進行對比，根據美國醫學遺傳學會對基因芯片拷貝數變異結果解讀指南[7]進行分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 孕婦染色體核型分析結果

453例孕婦羊水細胞培養及染色體核型分析均成功(100.00%)，共檢出染色體變異43例(9.49%)，其中染色體數目異常29例(6.40%)、染色體結構異常8例(1.77%)、染色體多態變異6例(1.32%)。染色體數目異常包括非整倍體26例(5.74%)，嵌合體3例(0.66%)；染色體結構異常包括平衡重組2例(0.44%)，非平衡重組5例(1.10%)，標記染色體1例(0.22%)。

2.2 孕婦CMA結果

453例孕婦CMA均成功(100.00%)，共檢出染色體變異51例(11.26%)，其中臨床致病性CNVs 28例(6.18%)，臨床意義不明CNVs 12例(2.65%)，可能臨床致病性CNVs 5例(1.10%)，良性CNVs 4例(0.88%)，LOH 2例(0.44%)。

2.3 染色體核型分析與CMA結果比較

染色體核型分析與CMA的染色體變異檢出率比較，差異無統計學意義(χ2=0.760，P=0.383)。染色體核型分析與CMA結果均異常的35例，檢查結果相符合29例(82.86%)，不符合6例(17.14%)。染色體核型分析與CMA均可檢出染色體數目異常、染色體大片段重復和缺失；染色體核型分析可檢出染色體倒位和嵌合，但對CNVs檢查敏感度較低；CMA可檢出CNVs、LOH，但對染色體倒位和嵌合的檢出位點與染色體核型分析不同。見表1。

表1 染色體核型分析與CMA染色體變異中檢測結果不符合病例分析

2.4 染色體核型分析正常但CMA異常病例分析

CMA檢出的51例染色體變異孕婦中，10例染色體核型分析正常。見表2。

表2 染色體核型分析正常但CMA異常病例分析

2.5 染色體核型分析結果異常但CMA正常病例分析

染色體核型分析檢出的43例染色體變異孕婦中，7例CMA結果正常。見表3。

表3 染色體核型分析結果異常但CMA正常病例分析

2.6 染色體核型和CMA對不同產前檢查結果孕婦的染色體變異檢出率比較

453例孕婦中，產前檢查具有單項診斷指征異常325例，兩項及以上診斷指征異常128例，染色體核型分析和CMA的染色體變異檢出率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；CMA在兩項及以上診斷指征異常孕婦中染色體變異檢出率高于染色體核型分析(P<0.05)，兩種檢查方法對單項診斷指征異常孕婦的染色體變異檢出率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 染色體核型和CMA對不同產前檢查結果孕婦的染色體變異檢出率比較[n(%)]

3 討論

CNVs廣泛存在于人類基因組中1 Kb～3 Mb的染色體變異，其中包括傳統染色體核型分析無法檢測的微缺失及微重復，與新生兒出生缺陷密切相關[8]。染色體核型分析作為產前診斷的主要方法，對染色體易位、倒位、三倍體和嵌合體等多種染色體異常診斷準確度較高，但該技術耗時較長、分辨率較低，對于≤5 Mb的染色體變異無法做出正確判斷[9]。CMA分辨率高，且無需進行細胞培養，可檢出50～100 Kb染色體變異。胡婷等[10]發現與傳統染色體核型分析結果相比，CMA可明顯提高超聲異常胎兒染色體異常的檢出率。

本研究顯示，453例孕婦染色體核型分析及CMA均成功檢測，兩種檢測方法的染色體變異檢出率比較，無明顯差異，與李閃閃等[11]研究基本一致。針對產前檢查存在診斷指征異常的孕婦行CMA和染色體核型分析有助于臨床胎兒染色體異常的診斷及評估。本研究進一步比較兩種檢測方法的結果可知，染色體核型分析與CMA結果均異常的35例，檢查結果相符合29例(82.86%)，不符合6例(17.14%)。其中，染色體核型分析與CMA均可檢出染色體數目異常、染色體大片段重復和缺失；染色體核型分析可檢出染色體倒位和嵌合，但對CNVs檢查敏感度較低；CMA可檢出CNVs、LOH，但對染色體倒位和嵌合的檢出位點與染色體核型分析不同。染色體微缺失/微重復改變了正常基因組部分片段的拷貝數，CMA技術可一次性分析大量基因組序列，實現了對全基因組的均勻覆蓋，可對全基因組內的微缺失/微重復區域同時進行檢測，對于CNVs的診斷存在明顯優勢[12]。本研究中，10例染色體核型分析正常孕婦，經CMA診斷為染色體變異。除2例臨床意義不明外，均具有明確的致病性。CMA可檢出約3.17 Mb、753 Kb的22 q11.21缺失和Xp 22.33缺失，染色體核型分析無法檢出，表明CMA在檢測CNVs方面具有較高的分辨率和敏感度。史楊等[13]也發現CMA較傳統的染色體核型分析能額外檢出CNVs，從而提高染色體結構異常的檢出率。本研究表明，7例染色體核型分析結果顯示為染色體變異的孕婦，經CMA結果正常。染色體異常包括易位、倒位、嵌合等，提示與CMA相比，染色體核型分析可更好地檢出染色體平衡易位和嵌合體。這可能與染色體嵌合比例較低，CMA無法檢出有關[14]。本研究還發現，單項診斷指征異常孕婦與兩項及以上診斷指征異常孕婦的染色體核型分析、CMA的染色體變異檢出率比較，差異均有統計學意義；CMA在兩項及以上診斷指征異常孕婦中染色體變異檢出率明顯高于染色體核型分析。這可能與產前篩查對于目標染色體異常的檢出率較高有關[15]。因此，臨床針對存在診斷指征異常的孕婦，應考慮及時行染色體核型分析、CMA產前診斷。

綜上所述，傳統染色體核型分析及CMA在孕婦染色體變異的檢出方面效果相當，具有一定互補性，臨床可將兩種檢查方法聯合應用在產前診斷中，以提高染色體變異檢出率，從而降低新生兒出生缺陷。