血清miR-1228-3p和miR-369-3p水平與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系

袁亞迪，張海濤，王樂朋，李麗，文璐，劉玉

(1.都江堰市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 都江堰 611830；2.巴音郭楞蒙古自治州人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科監(jiān)護(hù)病區(qū)，新疆 庫爾勒 841000；3.彭州市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 彭州 611930；4.四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤科，四川 成都 610041)

肺癌按組織病理學(xué)可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)、非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC占肺癌的75%，NSCLC包括腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌與腺癌混雜亞型等[1]，盡管肺癌的靶向治療等新治療方案取得了重大進(jìn)展，但仍有70%肺癌患者在確診時(shí)處于晚期或已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因而尋找新的治療靶標(biāo)及預(yù)后生物標(biāo)志物迫在眉睫[2]。微小RNA(micro RNA,miRNA)為一種長度約21～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，成熟的miRNA為一段有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體剪切后形成，miRNAs為涉及基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼RNA片段，存在多種形式，可調(diào)控RNA降解、抑制翻譯起始過程，對(duì)靶基因發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用，miRNAs在生物體中參與細(xì)胞分化、增殖及凋亡等生物過程[3]。miR-1228-3p、miR-369-3p作為重要的miRNA，可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，與乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥密切相關(guān)[4]，但關(guān)于血清miR-1228-3p、miR-369-3p與NSCLC的關(guān)系及對(duì)其預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值報(bào)道甚少，本研究擬探討血清miR-1228-3p、miR-369-3p與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月至2019年5月都江堰市人民醫(yī)院收治的NSCLC患者106例，記為惡性組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，均經(jīng)手術(shù)確定病理類型為腺癌及鱗癌，且收集血液標(biāo)本前無化療史或放療史；(2)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期(tumor node metastasis classification，TNM)為Ⅱ～Ⅳ期；(3)完成1年的隨訪，生存資料完整可供分析。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他部位惡性腫瘤或既往有惡性腫瘤史；(2)收集血液標(biāo)本前有肺部手術(shù)史或放化療史；(3)臨床資料不完整，未滿足1年隨訪即脫落者。另將同期入院的肺部良性病變者40例納入良性組，患者臨床資料收集、標(biāo)本采集均獲得其知情同意。惡性組中，病理類型：腺癌56例，鱗癌50例；分化程度：低分化38例，中分化40例，高分化28例；TNM分期：Ⅱ期36例，Ⅲ期36例，Ⅳ期34例；臨床分期：Ⅱ～Ⅳ期，Ⅰ期10例，Ⅱ期29例，Ⅲ期34例，Ⅳ期33例。良性組中，慢性肺炎21例，支氣管肺炎11例，肺結(jié)節(jié)5例，肺氣腫3例，均經(jīng)肺部影像學(xué)及病原體檢測(cè)等確診。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 miR-1228-3p、miR-369-3p水平的測(cè)定 (1)血樣采集：抽取入組對(duì)象6 mL外周血送外檢，以miRNA快速提取試劑盒(Hai Gene公司)提取總miRNA，并應(yīng)用NanoDrop進(jìn)行RNA定量與質(zhì)檢；(2)應(yīng)用加尾法逆轉(zhuǎn)錄miRNA為cDNA，首先以polyA聚合酶將polyA尾添加至0.5 μg總RNA中，后以M-MLV cDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(盛科博源)將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR)：應(yīng)用miR-1228-3p、miR-369-3p SYBR Green miRNA熒光定量PCR試劑盒(上海聯(lián)邁生物，貨號(hào)：LM0005)于ABI 7500儀器上進(jìn)行PCR反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。方法：將逆轉(zhuǎn)錄得到的1μL cDNA加入至含10 μL 2×SYBR mix與0.2 μmol/L正向引物及反向引物的20 μL qPCR mix中。U6上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，擴(kuò)增片段長度89 bp，miR-1228-3p上游引物為5’-TCAGTGCATCACAGAACTTTGT-3’，擴(kuò)增片段長度125 bp，下游引物為5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；miR-369-3p上游引物為5’-CTTGACATGATTAGCTGGCATGATT-3’，下游引物為5’-CCTGTGCAATATGCCGTGTAGA-3’，擴(kuò)增片段長度174 bp。PCR于ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中進(jìn)行，預(yù)變性95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s(40個(gè)循環(huán))，60 ℃ 1 min(1個(gè)循環(huán))。將所有樣品以人U6基因表達(dá)量為內(nèi)參，對(duì)RT-qPCR產(chǎn)物的細(xì)胞拷貝數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(目標(biāo)miRNA△△Ct值=目標(biāo)miRNA的Ct值-同一樣本外參Ct值)，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組△Ct-對(duì)照組△Ct，應(yīng)用2-△△Ct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，所有反應(yīng)均進(jìn)行3次后計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2 資料收集 收集NSCLC患者臨床資料，包括性別、年齡、吸煙史、病理類型、腫瘤分化程度、腫瘤分期、腫瘤大小、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，分析miR-1228-3p、miR-369-3p水平與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。同時(shí)記錄入院時(shí)血清腫瘤標(biāo)志物[癌胚抗原(CEA)、糖類抗原125(CA125)、細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)]，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清CEA、CA125、YFRA21-1、SCC-Ag，參考范圍：CEA 0～5.0 μg/L，CA125 0～25.0 U/mL，CYFRA21-1 0～3.3 ng/mL，SCC-Ag 0～1.5 μg/L。分析miR-1228-3p、miR-369-3p水平對(duì)NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.2.3 隨訪及預(yù)后分析 經(jīng)電話、郵寄、復(fù)查等方式進(jìn)行隨訪，末次隨訪時(shí)間為2019年12月1日，每3個(gè)月隨訪1次，對(duì)有癥狀者予以相應(yīng)檢查，隨訪期間復(fù)查(如病史詢問、體格檢查、胸部CT等)，記錄其預(yù)后情況。依據(jù)隨訪1年內(nèi)預(yù)后情況將其分為存活組、死亡組，比較兩組入院時(shí)血清腫瘤標(biāo)志物并分析預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組血清腫瘤標(biāo)志物及miR-1228-3p、miR-369-3p水平比較

惡性組血清CEA、CA125、CYFRA21-1、miR-1228-3p、miR-369-3p水平均高于良性組(P<0.05)；兩組SCC-Ag水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組血清腫瘤標(biāo)志物及miR-1228-3p、miR-369-3p水平比較

2.2 miR-1228-3p、miR-369-3p水平與NSCLC患者病理參數(shù)的關(guān)系

NSCLC中，腺癌患者miR-1228-3p表達(dá)水平高于鱗癌，腫瘤分期Ⅳ期患者miR-1228-3p、miR-369-3p表達(dá)水平高于腫瘤分期Ⅱ～Ⅲ期者，腫瘤大小≥3 cm者miR-1228-3p表達(dá)水平高于腫瘤大小<3 cm者，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者miR-1228-3p、miR-369-3p表達(dá)水平高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。不同性別、年齡、吸煙史、腫瘤分化程度患者miR-1228-3p、miR-369-3p表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 miR-1228-3p、miR-369-3p水平與NSCLC患者病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 miR-1228-3p、miR-369-3p水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

106例患者獲得1年隨訪，20例在隨訪1年內(nèi)死亡，死亡率為18.87%(20/106)。死亡組患者入院時(shí)血清CEA、CYFRA21-1、miR-1228-3p、miR-369-3p水平高于存活組(P<0.05)；兩組CA125、SCC-Ag水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 miR-1228-3p、miR-369-3p水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 miR-1228-3p、miR-369-3p水平對(duì)NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線顯示，miR-1228-3p、miR-369-3p預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的曲線下面積優(yōu)于CEA、CYFRA21-1。見表5及圖1。

表5 miR-1228-3p、miR-369-3p水平對(duì)NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

肺癌無典型臨床表現(xiàn)，被確診時(shí)多處于晚期，患者5年生存率低于20%，目前肺癌的診斷主要采用CT、血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、痰細(xì)胞學(xué)檢查等無創(chuàng)檢查手段，但CT檢查有費(fèi)用高、電離輻射、假陽性率高等缺點(diǎn)，因而尋找相對(duì)無創(chuàng)、更安全及敏感性與特異性更高的標(biāo)志物對(duì)NSCLC的診斷尤為重要[6]。miRNAs除在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用外，也存在于體液中，以從裂解細(xì)胞中被動(dòng)釋放、經(jīng)囊泡的主動(dòng)釋放、以非囊泡形式主動(dòng)分泌三種方式產(chǎn)生，miRNAs與mRNA進(jìn)行堿基配對(duì)在各種生物過程如炎癥、DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞生長與凋亡、基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方面發(fā)揮作用[7]。miR-1228-3p、miR-369-3p是近年來發(fā)現(xiàn)的、參與多種疾病過程的重要miRNA。

本研究顯示，惡性組血清CEA、CA125、CYFRA21-1、miR-1228-3p、miR-369-3p水平高于良性組，相比于肺部良性病變，NSCLC患者血清miR-1228-3p、miR-369-3p水平呈高表達(dá)。miR-1228-3p位于12號(hào)染色體的LRP1基因內(nèi)，此基因主要涉及細(xì)胞代謝與細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也是維持細(xì)胞存活的關(guān)鍵組成部分。薛唯瀟[8]研究表明，miR-1228-3p對(duì)NSCLC的早期診斷有重要意義，miR-1228-3p高表達(dá)的NSCLC患者中位生存期更短，miR-1228-3p高表達(dá)是NSCLC患者生存期的危險(xiǎn)因素，說明miR-1228-3p可作為NSCLC診斷及預(yù)后評(píng)估的潛在標(biāo)志物，本研究結(jié)果與之一致。Ogawa等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-369-3p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，通過敲低乳酸脫氫酶A的表達(dá)，而導(dǎo)致乳酸、三磷酸腺苷產(chǎn)生及葡萄糖的攝取減弱，減慢結(jié)直腸癌生長速度；Liu等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-369-3p可通過自噬調(diào)節(jié)參與子宮內(nèi)膜樣腺癌病變發(fā)展。本研究也觀察到，惡性組miR-369-3p相對(duì)表達(dá)量高于良性組，表明miR-369-3p在NSCLC發(fā)生發(fā)展中也有促進(jìn)作用。第13屆全國肺癌學(xué)術(shù)大會(huì)[11]也提出，人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981中存在miR-369-3p過表達(dá)，且miR-369-3p在L9981細(xì)胞中的表達(dá)可能與L9981細(xì)胞的遷移能力及侵襲能力有關(guān)，miR-369-3p可能通過WSB1基因參與調(diào)節(jié)L9981的遷移與侵襲，而發(fā)揮調(diào)節(jié)NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的作用，關(guān)于其機(jī)制可進(jìn)一步進(jìn)行研究。

miR-1228-3p、miR-369-3p主要經(jīng)與mRNA的3’-UTR區(qū)域結(jié)合而產(chǎn)生直接降解靶基因或抑制其翻譯的效應(yīng)，從而在轉(zhuǎn)錄后水平密切參與調(diào)控基因的表達(dá)[12]，本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC中，病理類型、腫瘤分期、腫瘤大小、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與患者miR-1228-3p表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明miR-1228-3p、miR-369-3p表達(dá)水平也與其病理進(jìn)展有關(guān)，miR-1228-3p、miR-369-3p可能推進(jìn)NSCLC的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)其惡化與轉(zhuǎn)移，監(jiān)測(cè)miR-1228-3p、miR-369-3p對(duì)NSCLC有一定診斷和評(píng)估價(jià)值。

血清腫瘤標(biāo)志物，如CEA、CYFRA21-1、SCC-Ag等是診斷NSCLC的常見標(biāo)志物，但在NSCLC患者診斷及預(yù)后評(píng)估中敏感度與特異度不高[13]。本研究中，死亡組患者入院時(shí)血清CEA、CYFRA21-1、miR-1228-3p、miR-369-3p水平高于存活組，ROC曲線顯示，miR-1228-3p、miR-369-3p預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的曲線下面積優(yōu)于CEA、CYFRA21-1，表明相比于傳統(tǒng)血清腫瘤標(biāo)志物，miR-1228-3p、miR-369-3p預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后效果更有優(yōu)勢(shì)。miRANs對(duì)30%人類基因有負(fù)性調(diào)控作用，miRNAs在生理?xiàng)l件下可調(diào)節(jié)各種生物途徑，如細(xì)胞分裂、分化及凋亡等[14]，而miR-1228-3p、miR-368-3p分別為miR-1228、miR-369的成熟剪輯體之一，監(jiān)測(cè)血清miR-1228-3p、miR-368-3p水平可較好推斷NSCLC進(jìn)展情況及腫瘤預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)[15]。因此RT-PCR檢測(cè)NSCLC患者血清miR-1228-3p、miR-369-3p水平可作為一種可行的液體活檢手段，用于評(píng)估NSCLC患者預(yù)后。

綜上所述，miR-1228-3p、miR-369-3p與NSCLC患者病理參數(shù)(病理類型、腫瘤分期、腫瘤大小、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等)密切相關(guān)，可用于預(yù)測(cè)NSCLC預(yù)后，有望作為NSCLC管理的新型標(biāo)志物。