兒童良性癲疒間伴中央顳區(qū)棘波與SV2A基因多態(tài)性的研究

張羽航 徐向平

兒童良性癲疒間伴中央顳區(qū)棘波(benign childhood epilepsy with centrotemporal spikes，BECTS)為兒童期最常見的癲疒間綜合征之一，迄今BECTS的病因尚不明確，大量研究證實該病為遺傳相關(guān)性疾病，因此,本病的基因型研究已成為研究熱點。SV2A是新型抗癲疒間藥物左乙拉西坦的作用靶點，其通過參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和囊泡循環(huán)維持突觸囊泡的正常功能，在神經(jīng)遞質(zhì)釋放的過程中有一定的作用。左乙拉西坦可減少中央顳區(qū)棘波(central temporal spikes，CTS)放電，有效控制BECTS臨床發(fā)作。由此推測SV2A可能參與了BECTS的發(fā)生，BECTS患兒體內(nèi)可能存在SV2A基因的缺失或突變，導(dǎo)致該基因的異常表達，從而增加BECTS患病風(fēng)險。

對象與方法

一、對象

1.BECTS組：符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的兒童良性癲疒間伴中央顳區(qū)棘波(BECTS)患者69例，為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科2014年9月至2016年11月期間門診、住院處患兒。其中男性37例，女性32例，年齡3～14歲。所有患者均已行24 h腦電圖證實存在CTS放電。

BECTS診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2001年國際抗癲疒間聯(lián)盟提出的癲疒間綜合征的分類[1]，即(1)首發(fā)年齡3～13歲，有自發(fā)緩解傾向，多在16歲以前消失；(2)臨床主要表現(xiàn)為部分性發(fā)作，也可以繼發(fā)全身強直陣攣發(fā)作，經(jīng)常在睡眠中發(fā)作；(3)無智力障礙或者神經(jīng)系統(tǒng)病變，無相關(guān)疾病既往史；(4)無精神疾病病史；(5)無營養(yǎng)不良、貧血、肝、肺、心、腎等慢性病史。

2.對照組：選擇2014年9月至2016年11月期間哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一院兒內(nèi)科門診和住院處的非BECTS的癲疒間患兒99例，其中男性57例，女性42例，年齡1～16歲，均已行24 h腦電圖排除存在CTS放電，患者發(fā)作類型及頻數(shù)分布見表1。

表1 對照組癲疒間發(fā)作類型及頻數(shù)分布表Table 1 Epileptic seizure type and frequency distribution in control group

本研究中所有兒童及家長均在知情同意的情況下參加本研究，并簽署知情同意書。本研究獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

二、方法

1.血液樣品DNA的提取：

(1)準(zhǔn)備。①移取5.5 Ml Protease Solvent放入含有凍干QIAGEN Protease的瓶子。②混合AL(含有高濃度的鹽酸胍的裂解液)之前要搖晃混勻。③緩沖液(AW1、AW2)在第一次使用之前，添加適量的乙醇96%～100%，AW1加130 mL，AW2加160 mL。④準(zhǔn)備PBS。⑤高壓1.5 mL、2 mL離心管。

(2)過程。①移取20 uL QIAGEN Protease 放入1.5 mL離心管。②離心管里加入200 uL樣品，200 uL全血與200 Ul PBS混合。③在樣品里加入200μL Buffer AL，渦旋15 s。④56℃孵化10 min。⑤瞬離離心管。⑥在樣品中加入200 uL乙醇，混合，渦旋15 s，瞬離1.5 mL離心管。⑦小心的將步驟⑥的混合物放在柱子上(在2 mL收集管里)不將邊緣弄濕，關(guān)閉蓋子，離心機在6 000×G(8 000轉(zhuǎn))1 min，把柱子放在干凈的2 mL收集管里，丟棄含有濾液的管。⑧小心地打開QIAamp柱子在無潤濕邊緣加入500μL AW1。關(guān)閉蓋子在離心機在6 000×G(8 000轉(zhuǎn))1 min，把QIAamp 柱子放在干凈的2 mL離心管里，丟棄含有濾液的管。⑨小心地打開QIAamp柱子在無潤濕邊緣加入500μL Buffer AW2，關(guān)閉蓋子，離心機在(20,000 xg;14,000 rpm) 3 min。⑩把QIAamp 柱子放在新的2 mL離心管里，丟棄舊的含有濾液的收集管，離心機13 000 rpm、1 min。⑾把QIAamp 柱子放在干凈的1.5 mL離心管里，丟棄含有濾液的管，小心地打開QIAamp柱子，加入200μL Buffer AE，在室溫(15℃～25℃)孵化1 min，離心6 000 g ×(8 000轉(zhuǎn))1 min。

2.引物設(shè)計:Agena公司在線引物設(shè)計軟件Assay Design Suite v 2.0自動設(shè)計SNP基因分型的PCR引物和延伸引物，SNP位點引物設(shè)計序列詳見表2。

表2 引物設(shè)計序列Table 2 Primer design sequence

3.MassARRAY 基因分型實驗:本實驗部分由上海吉凱基因科技有限公司完成。

(1)Nanodrop DNA質(zhì)檢。用2μL純化后的DNA經(jīng)Nanodrop測量，質(zhì)檢合格后的DNA樣本方可進行后續(xù)的分型實驗(合格標(biāo)準(zhǔn)：DNA濃度 >10 ng/μL,不符合此條件則判定為該樣本不合格，不進行后續(xù)分型實驗)。本實驗168例樣本DNA質(zhì)檢全部合格，將質(zhì)檢合格的DNA濃度調(diào)整至50 ng/uL，轉(zhuǎn)移至384孔板，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

(2)PCR擴增。采用多重PCR技術(shù)，在384孔板中進行，每個反應(yīng)體系總體積為5 uL。① 在一個新的1.5 mL EP管中配制PCR master mix 溶液。配制PCR master mix 溶液見表3。

表3 master mix 溶液Table 3 Master mix solution

② 使用24通道加樣器，調(diào)節(jié)加樣體積為4 uL，在384孔板的每個加樣孔中加入PCR master mix 溶液，該384孔板即為PCR反應(yīng)板。

③取出已經(jīng)制備好的DNA樣品384孔板，使用24通道加樣器，調(diào)節(jié)加樣體積為1 uL，每個5 uL PCR反應(yīng)體系中包含模板DNA 20～50 ng，Hotstar Taq 0.5 U,每條擴增引物0.5 pmol，0.1 uL的25 mM dNTPs。

④在兼容384孔板的PCR儀上設(shè)定PCR反應(yīng)條件,即94℃ 4 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，45個循環(huán)；72℃ 3 min，4℃ 保持。將384孔PCR反應(yīng)板放置于PCR儀上，啟動PCR反應(yīng)。

(3)PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶處理。①在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用SAP(蝦堿性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dNTPs。

②配制堿性磷酸酶處理反應(yīng)液，SAP Mix。見表4。

表4 堿性磷酸酶處理反應(yīng)液Table 4 Reaction solution treated with Alkaline phosphatase

③使用24通道加樣器，調(diào)節(jié)加樣體積為2 uL，將SAP Mix加入384孔PCR反應(yīng)板。對于每個堿性磷酸酶處理反應(yīng)孔，反應(yīng)體系總體積為7 uL，其中PCR產(chǎn)物5 uL，SAP混合液2 uL(SAP 0.5 U，buffer 0.17 uL)。

④將384孔板放置在兼容384孔板的PCR儀上，設(shè)定PCR反應(yīng)條件為37℃ 40 min，85℃ 5 min；4℃維持，啟動PCR儀進行堿性磷酸酶處理。

(4)單堿基延伸。

①在堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積9 uL。

②配置單堿基延伸反應(yīng)液，EXTEND Mix。見表5。

表5 單堿基延伸反應(yīng)液Table 5 Single base extension reaction solution

③使用24通道加樣器，調(diào)節(jié)加樣體積為2 uL，將EXTEND Mix對應(yīng)加入384反應(yīng)板。對于每個反應(yīng)孔，單堿基延伸反應(yīng)體系包括SAP處理后PCR產(chǎn)物7 uL，EXTEND Mix液2 uL(其中各延伸反應(yīng)引物混合物0.94 uL，iPLEX酶0.04 uL，延伸混合物0.20 uL)。

④將384孔板放置在兼容384孔板的PCR儀上，設(shè)定PCR反應(yīng)條件,94℃ 30 s，94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，52℃ 5 s；四個循環(huán)；94℃ 5 s；39個循環(huán)；72℃ 3 min，4℃ 維持，啟動PCR儀進行單堿基延伸反應(yīng)。

(5)樹脂純化。

①將Clean Resin樹脂平鋪到6 mg的樹脂板中。

②加16 uL水加到延伸產(chǎn)物的對應(yīng)孔內(nèi)。

③將干燥后的樹脂倒入延伸產(chǎn)物板中，封膜，低速垂直旋轉(zhuǎn)，引物充分接觸。

④離心使樹脂沉入孔底部。

(6)芯片點樣。擴增產(chǎn)物經(jīng)樹脂除鹽純化后，點樣到覆蓋有基質(zhì)的SpectroCHIP芯片陣列中。

(7)質(zhì)譜檢測。基質(zhì)表面的分子基質(zhì)表面的分子，在激光的照射下解吸并電離，電荷離子按照其質(zhì)荷比率在加速電場真空小管中飛行到達檢測器。

(8) 數(shù)據(jù)分析。MassARRAYTyper軟件自動解讀質(zhì)譜檢測的分子量峰，轉(zhuǎn)化顯示為SNP位點所對應(yīng)的分子量質(zhì)譜峰圖。

4.統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS19.0軟件進行分析，采用卡方檢驗比較各個SNP位點基因型在BECTS組和對照組的差異關(guān)系。計算比值比(odds ratio，OR)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

通過對BECTS組和對照組癲疒間患者41個SNP位點基因型進行檢測，發(fā)現(xiàn)有33個位點兩組均為同種純合基因型，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表6；有8個位點兩組含有純合基因型與雜合基因型兩種類型，其中rs577935位點，BECTS組為62例GG純合型，7例AG雜合型；對照組為77例GG純合型，22例AG雜合型，攜帶GG基因型為攜帶AG基因型患病率的2.531倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而rs111783832位點，BECTS組全部為TT純合型，對照組有50例為TT基因型，43例存在T堿基缺失，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其余位點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表6。

一、SNP基因分型結(jié)果

檢測中DNA標(biāo)本全部合格，99.6%的樣本位點具有分型結(jié)果。見表6。

二、統(tǒng)計分析

上述表6中所列BECTS組及對照組基因型均為純合型的位點，兩組間基因型差異無統(tǒng)計學(xué)意義，不納入統(tǒng)計學(xué)分析，現(xiàn)就rs564542，rs12072695，rs28642307，rs4926386，rs577935，rs626785，rs115160215，rs111783832共8個位點兩組基因型進行分析，結(jié)果見表7。

表6 SNP基因分型結(jié)果Table 6 SNP genotyping results

表7 BECTS組與對照組SNP位點基因型比較 Table 7 Comparison of SNP locus genotype between BECTS group and control group

討 論

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指基因水平某特定核苷酸位點存在兩個不同的堿基，其中最少的一種在群體中的頻率大于1%, SNP主要由單個堿基轉(zhuǎn)換或顛倒(如G->A，T->C )，亦有部分發(fā)生于嘌呤和嘧啶之間的顛換[2]。繼微衛(wèi)星之后，SNP成為了第三代遺傳標(biāo)記，在人體基因組中每1 000個堿基就有一個SNP，人體許多表型上的差異和對疾病的易感性等都可能與SNP有關(guān)。

BECTS是兒童時期最常見的癲疒間綜合征， 1989年國際抗癲疒間聯(lián)盟協(xié)會將其歸入到原發(fā)性部分性癲疒間綜合征，2001年國際抗癲疒間聯(lián)盟的重新分類中，把BECTS歸入到與部位及患者年齡大小有關(guān)的特發(fā)性癲疒間綜合征，發(fā)病的年齡在3～13歲之間，其中8～10歲為發(fā)病高峰[1]。BECTS腦電圖最顯著特點是雙側(cè)、局灶性棘波或尖波放電，后面常跟有慢波[3]。CTS可能是BECTS臨床亞型和遺傳學(xué)證據(jù)的亞臨床標(biāo)記。最近的家系研究發(fā)現(xiàn)BECTS在有熱性驚厥及癲疒間失語譜系障礙的家族中發(fā)病率增加[4]。許多位點或基因與CTS放電有關(guān)，Neubauer等[5]研究發(fā)現(xiàn)少數(shù)BECTS患者與KCNQ2和KCNQ3有關(guān)，Roll等[6]在同時伴有精神發(fā)育遲滯、嚴(yán)重的語言障礙和中央顳區(qū)癲疒間的兩個家庭發(fā)現(xiàn)SRPX2的突變，全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)BECTS及CTS放電與ELP4有關(guān)[7]，此外, Endele等[8]在一個早發(fā)性癲疒間腦病伴CTS放電的女孩基因發(fā)現(xiàn)GRIN2A突變。Lal等[9]發(fā)現(xiàn)RBFOX1和RBFOX3基因的突變與BECTS發(fā)生有關(guān)。然而,所有這些發(fā)現(xiàn)僅局限在單個患者、幾個患者或小家系，缺乏群體共性。

人類SV2A基因位于1號染色體的長臂2區(qū)1帶2亞帶，約含有14 565個堿基對，其編碼的mRNA含有13個外顯子，含有4 353個堿基對，其翻譯的蛋白質(zhì)分子量為82.6 KD，由742個氨基酸構(gòu)成，SV2A的啟動子區(qū)的共同序列原件中包含了不同的轉(zhuǎn)錄因子，如adaptor protein-1、p53、RSRFC4、interferon regulatory factor1、ary1 hydrocarbon receptor和Pax-2[10]。但尚無證據(jù)顯示這些轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控SV2A的表達。SV2A含有12個疏水跨膜區(qū)和1個含3個N-糖基化位點的突觸泡內(nèi)大環(huán)。SV2A胞質(zhì)面N端第57個氨基酸是與Ca2+敏感蛋白突觸結(jié)合蛋白(synaptotagmin，SYT-1)C2B結(jié)構(gòu)域相互作用的主要部位。SYT-1是Ca2+通路介導(dǎo)胞吐過程的第一個受體，SV2A和SYT-1以Ca2+依賴的方式相互作用。SV2A N端含酪氨酸的內(nèi)吞膜體結(jié)構(gòu)(Tyr46)對SV2A和SYT-1向囊泡表面運輸起著關(guān)鍵作用；SV2A同樣包含有ATP結(jié)合位點，分別位于TMR1和7胞質(zhì)端內(nèi)側(cè)部分，因而推測它可能是一個ATP結(jié)合蛋白，并且由腺嘌呤核苷酸調(diào)控著突觸囊泡的引燃過程[11]。

SV2A存在于低等脊椎動物和高等哺乳動物的神經(jīng)元和內(nèi)分泌細(xì)胞中，主要表達在突觸密集的區(qū)域，可維持神經(jīng)遞質(zhì)的正常功能，在顳葉癲疒間和海馬硬化患者海馬中的SV2A會明顯減少[12]，有研究表明SV2A表達的減少可能會造成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的不穩(wěn)定性從而引起癲疒間的發(fā)生[13-14]。2015年，Serajee等[15]發(fā)現(xiàn)難治性癲疒間患者SV2A基因的純合突變，該突變基因位于SV2A基因外顯子5，導(dǎo)致氨基酸第383位點(R383Q)發(fā)生精氨酸—>谷氨酸的改變，其父母均為R383Q突變位點的攜帶者，這說明該突變?yōu)殡[性突變，目前R383Q變化在已知健康人群、外顯子組數(shù)據(jù)庫及SNP數(shù)據(jù)庫未被檢測到。此例報道為SV2A基因突變導(dǎo)致癲疒間的第一例。

SV2A基因rs577935 SNP位點位于SV2A基因內(nèi)含子區(qū)域和5′非翻譯區(qū)，等位基因為G/A。本研究通過搜集BECTS患兒與非BECTS癲疒間患兒的EDTA抗凝全血標(biāo)本，提取血液DNA，進行SV2A基因41個SNP位點基因型檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有33個位點BECTS組與非BECTS組均為同種純合基因型，兩組間無差異；有7個位點BECTS組與非BECTS組含有純合基因型與雜合基因型兩種類型，其中rs577935位點，BECTS組為62例GG純合型，7例AG雜合型；對照組為77例GG純合型，22例AG雜合型，攜帶GG基因型為攜帶AG基因型患病率的2.53倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其余位點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。由此推測，SV2A基因rs577935 SNP位點攜帶等位基因G/A，當(dāng)發(fā)生A->G的變異時，則增加了BECTS發(fā)病的風(fēng)險。

SV2A基因rs111783832位點位于SV2A基因內(nèi)含子區(qū)域，攜帶等位基因-/T，在本研究中BECTS組基因型全部為TT純合型，對照組共有99例，其中有50例為TT純合型，43例為DEL.T，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。由此推測，當(dāng)SV2A基因rs111783832位點的基因型為TT型時，BECTS發(fā)病風(fēng)險將明顯增加。SV2A基因rs577935和rs111783832位點均位于非編碼區(qū)域，當(dāng)這兩個位點的基因發(fā)生變異時，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過程中的異常剪接，從而導(dǎo)致功能性SV2A蛋白含量的下降，進而引起神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的異常，促進BECTS的發(fā)生。

綜上所述，SV2A基因rs577935 SNP位點的GG基因型可能與BECTS發(fā)生有關(guān)；SV2A基因rs111783832 SNP位點的TT基因型可能與BECTS發(fā)生有關(guān)。基因型的確定可以幫助BECTS的診斷和治療，特別是對于藥物控制不理想的患者，在應(yīng)用左乙拉西坦治療的同時，未來或許能夠?qū)崿F(xiàn)對其采取基因治療的方法；對患者子代SV2A基因位點進行檢測，或可以早期干預(yù)，減少其發(fā)病幾率，提高生活質(zhì)量。