沉默FOXC1對宮頸癌HeLa細胞侵襲和轉移能力的影響

張婕 汪露 韓世愈

宮頸癌(cervical cancer，CESC)屬于女性生殖系統惡性腫瘤，發病率及死亡率較高，對女性生命和健康存在極大威脅。據統計，全球每年新發病例約53萬人，死亡人數高達27萬人[1]。臨床統計資料顯示，80%以上有夫妻生活經歷的女性存在程度不等的宮頸疾病困擾，而處于17歲～28歲階段的女性更易患宮頸疾病，一些女性未及30歲即發生了早期宮頸病變，有的甚至出現晚期宮頸病變，在發病年齡方面相較于以往提早了近十年[2]。在惡性腫瘤的遷移與侵襲活動中，上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)發揮著關鍵性影響。腫瘤的形成與發展過程涉及諸多基因以及步驟，其中EMT對于源于上皮的惡性腫瘤遷移與侵襲行為發揮著關鍵性影響[3]。EMT，即在一定生理與病理環境中上皮細胞轉分化為間充質細胞的行為。此行為發生期間，上皮細胞的細胞極性、細胞間的黏附性逐漸喪失，游走性能與侵入能力顯著提升[4]。叉頭框C1蛋白 (forkhead box protein C1， FOXC1)是一種新型轉錄因子，研究顯示，FOXC1在惡性腫瘤發病、進展過程中發揮著重要作用，例如，在鼻咽癌中檢測到FOXC1的高表達，而FOXC1通過上調波形蛋白、纖維連接蛋白和N-cadherin的表達[5]，在EMT中起到關鍵作用。FOXC1在乳腺癌中是EGFR功能的關鍵調節因子，目前已發現FOXC1的顯著上調可通過激活Hedgehog信號通路來調控癌癥干細胞特性的豐富[6]。在肝細胞癌中，FOXC1通過調節EMT參與微血管浸潤[7]。有報道表明，FOXC1的異常表達與多種癌癥的發生和發展有關，包括乳腺癌、肝細胞癌、胰腺癌和非小細胞肺癌[8-11]。然而，FOXC1的表達及其在宮頸癌中的潛在作用尚不清楚。本研究旨在探討沉默FOXC1的宮頸癌細胞的侵襲及轉移能力的影響情況，現將結果報告如下。

材料及方法

一、材料

正常宮頸細胞NC104與人宮頸癌 CaSki、ME-180、HeLa細胞購于中科院上海腫瘤研究所，細胞均用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液，置于37℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。引物設計后由上海生工合成，LipofectamineTM轉染試劑購于漢恒生物，pLKO.1-shFOXC1(本實驗室克隆)。β-catenin抗體、Vimentin抗體、E-cadherin抗體購于美國Affinty 公司，TRANSWELL小室及Matrigel基質膠購于corning公司。DMEM培養基和小牛血清購自Gibco公司。

二、四種細胞中FOXC1mRNA及蛋白水平表達

1.細胞總RNA用TRIzol試劑盒提取：RT-PCR 95℃ 30 s，95℃ 5 s 40個循環，60℃ 30 s。引物序列如下。

FOXC1:

5′-CTG CCC GAC TAC TCT CTG C-3′

5′-CAC CGA GTG GAA GTT CTG C-3′;

GAPDH:

5′-CGA GAT CCC TCC AAA ATC AA-3′

5′-TTC ACA CCC ATG ACG AAC AT-3′。

采用2-ΔΔCT法計算FOXC1 mRNA相對表達量。

2.Western Blot檢測四種宮頸癌細胞中FOXC1基因的表達：FOXC1蛋白表達采用Western blot法。收集四組細胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解充分約30 min，提取總蛋白，進行蛋白定量檢測并制備蛋白樣品。SDS-PAGE電泳，濕轉法轉膜，5% BSA搖床室溫封閉1 h，1×TBST洗滌3次，每次15 min。加入FOXC1(1∶1 000)和內參GAPDH(1∶1000)一抗，4 ℃孵育過夜，1×TBST洗滌3次，每次15 min;加入二抗(1∶2 000)室溫雜交1 h，1×TBST洗滌3次，每次15 min；ECL顯影、曝光。實驗均重復3次以上，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度值的比值計算FOXC1蛋白相對表達量。根據RT-PCR及Western blot檢測宮頸癌HeLa細胞中FOXC1表達量較高。

三、基因轉染

取對數生長期的HeLa細胞，無血清培養基重懸，調整細胞密度為4×105/mL，6孔板中每孔2 mL細胞懸液接種，常規培養。待細胞狀態良好且融合度達60%～80%時，更換為無血清培養基。實驗分為3組。 (1)對照組:轉染陰性的Hela細胞; (2)陰性對照組:用pc DNA3.1 (+) -neo質粒轉染Hela細胞; (3) 轉染特異性siRNA組:用pLKO.1-shFOXC1轉染Hela細胞。轉染方法參照Lipofectamine2000轉染方法進行操作。轉染48 h后進行培養， 3 d后嘌呤霉素篩選陽性細胞連代培養，通過倒置顯微鏡觀察轉染效率，RT-PCR及Western Blot檢測轉染后細胞中FOXC1mRNA及蛋白表達，達到穩定轉染后進行后續實驗。

四、Transwell小室遷移及侵襲實驗

1.檢測轉染后細胞遷移能力：制備細胞懸液，調整細胞濃度為5×105/mL。取細胞懸液200 μL加入Transwell上室， 下室中加入500 μL的DMEM培養液，小心消除基質膠與培養液間的氣泡。48 h后進行取樣，吸凈chamber上室內液體，無菌鑷子取出chamber，移至800 μL甲醇溶液內，室溫固定30 min。從甲醇溶液中取出chamber，吸干甲醇溶液，移至800 μL Giemsa染色液中，室溫染色30 min，后用去離子水沖洗后吸干液體，濕棉棒擦去chamber上室未遷移細胞，PBS沖洗3遍。倒置顯微鏡下隨機取9視野，并記數。

2.檢測轉染后細胞侵襲能力：用Matrigel基質膠包被Transwell小室基底膜，Matrigel膠4℃過夜融化備用，用4℃預冷的無血清DMEM培養基1∶3稀釋Matrigel至終濃度為1 mg/mL，冰上操作;滅菌槍頭包被小室的底部,37℃靜置1 h，使其干成膠狀。其余方法同遷移實驗，并記數。

五、檢測細胞轉染后β-catenin、Vimentin及E-cadherin蛋白表達

收集三組轉染48 h的細胞，實驗分組包括空白對照組(HeLa)、空載組(GFP- HeLa)、HeLa-FOXC1(-)組，分別提取細胞總蛋白，Western blot檢測 β-catenin、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達差異，參照二-2中采用Western blot法檢測β-catenin、Vimentin及E-cadherin蛋白相對表達量。

六、統計學處理：采用SPPS 17.0軟件進行數據分析。計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料用表示，采用單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、四種細胞中FOXC1 mRNA及蛋白表達

應用PCR及Western Blot方法檢測正常宮頸細胞NC104及宮頸癌 CaSki、ME-180、HeLa細胞株中FOXC1表達。PCR及Western Blot結果提示宮頸癌HeLa細胞中FOXC1高表達。

二、慢病毒轉染及篩選穩定轉染FOXC1細胞

1.以MOI=30 慢病毒感染HeLa細胞系，48 h后熒光顯微鏡觀察GFP熒光蛋白的表達情況見圖2。并以嘌呤霉素篩選出穩定表達FOXC1 shRNA的細胞，流式細胞儀分選計數，其平均熒光細胞比率為(93.71±0.26)%。

圖1 RT-PCR檢測四組細胞中FOXC1 mRNA相對表達量及Western Blot檢測四組細胞中FOXC1表達情況Figure 1 The relative expression of FOXC1 mRNA detected by RT-PCR and the expression of FOXC1 protein detected by Western blot

2.轉染48 h后，PCR檢測FOXC1mRNA的表達情況：各種的相對表達量見表1，其中轉染FOXC1特異性shRNA組與陰性對照組、對照組相比較，FOXC1的mRNA相對表達量顯著降低，差異具有統計學意義。

表1 FOXC1基因在各組中的表達情況Table 1 The expression of FOXC1 gene in three groups of

A: Observation results of ordinary light microscope； B: Observation results of green fluorescence microscope；C: Fusion diagram of A and B圖2 熒光顯微鏡下觀察HeLa-FOXC1(-)細胞系(放大倍數，×10倍)的熒光顯示轉染情況Figure 2 The transfection of -FOXC1 (-) cell line was observed under fluorescence microscope (magnification, ×10)

3.轉染48 h后Western Blot檢測轉染后三組細胞中FOXC1蛋白水平表達：轉染48 h后分別提取感染陰性組細胞HeLa、感染空載體組細胞HeLa-GFP以及感染FOXC1 shRNA組細胞HeLaFOXC1(-)的總蛋白，通過Western blot方法檢測三種細胞中FOXC1蛋白的表達差異，GAPDH作為內參，結果可見HeLa-FOXC1(-)組細胞內FOXC1蛋白的表達明顯降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 三組細胞中FOXC1蛋白相對表達情況Figure 3 The relative expression of FOXC1 protein in three groups

三、3組細胞Transwell遷移及侵襲實驗結果

1.使用Transwell小室24 h后檢測HeLa細胞系，GFP穩定株和FOXC1的干擾穩定株的細胞遷移情況：遷移結果顯示，敲減FOXC1基因后三組細胞遷移能力比較， HeLa-FOXC1(-)組細胞遷移能力明顯下降(P<0.05)，HeLa組與 HeLa-GFP組無明顯差異。見圖4。

圖4 Transwell小室24 h后三組細胞遷移情況(×40)Figure 4 Cell migration of crystal violet staining of shFOXC1 and control group cells that crossed the polycarbonate membrane of the Transwell chamber (×40)

2.用Transwell小室24 h時分別檢測HeLa細胞系，GFP穩定株和FOXC1的干擾穩定株的細胞侵襲情況：Transwell侵襲實驗結果顯示，敲減FOXC1基因后三組細胞侵襲能力比較， HeLa-FOXC1(-)組細胞侵襲能力明顯下降(P<0.05)，HeLa組與 HeLa-GFP組無明顯差異。見圖5。

圖5 Transwell小室24 h后三組細胞侵襲情況(×40)Figure 5 Cell invasion of crystal violet staining of the shFOXC1 and control group cells that crossed the Matrigel-coated polycarbonate membrane of the Transwell chamber to (×40)

四、Western blot檢測感染前后各組細胞 β-catenin、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達情況

由圖6所示，A:使用WB法檢測HeLa細胞系，GFP穩定株和FOXC1的干擾穩定株中E-cadherin,β-catenin和vimentin的蛋白表達情況；B：使用WB法檢測HeLa細胞系，GFP穩定株和FOXC1的干擾穩定株中E-cadherin的蛋白表達情況統計結果(P<0.05)；C：使用WB法檢測HeLa細胞系，GFP穩定株和FOXC1的干擾穩定株中β-catenin的蛋白表達情況統計結果(P<0.05)；D：使用WB法檢測HeLa細胞系，GFP穩定株和FOXC1的干擾穩定株中vimentin的蛋白表達情況統計結果(P<0.05)。結果可見，HeLa-FOXC1(-)組細胞內β-catenin及Vimentin蛋白的表達明顯降低，E-cadherin蛋白的表達有增高。

圖6 Western blot檢測感染前后各組細胞中 β-catenin、E-cadherin及Vimentin蛋白的表達情況及各組細胞中蛋白的相對表達量Figure 6 The expression of protein and the relative expression quantity ofβ-catenin, E-Cadhenrin and Vimentin detected by Western blot

討 論

侵襲和轉移是腫瘤臨床治療的難題及腫瘤患者死亡的主要原因。惡性腫瘤中上皮-間質轉變現象的發生是引起腫瘤遠處轉移的關鍵步驟。EMT出現的分子標志為N-cadherin、Fibronectin與Vimentin這3類間質標志物表達的提升，β-Catenin與E-cadherin這2類上皮標志物表達的缺失或降低[12-14]。本課題組前期研究中發現，FOXC1基因在宮頸癌患者的臨床病理中高表達，且隨著期別進展，FOXC1基因的表達有明顯增高，差異有統計學意義。本研究主要通過慢病毒RNA干擾技術，敲減宮頸癌HeLa細胞中FOXC1基因的表達，并通過倒置熒光顯微鏡及PCR、Western Blot方法驗證在HeLa-FOXC1(-)細胞中，FOXC1基因的mRNA及蛋白水平明顯降低，通過細胞培養技術獲得穩定沉默FOXC1的細胞系，通過Transwell遷移及侵襲實驗驗證，感染FOXC1-shRNA組細胞的遷移及侵襲能力明顯降低，進一步通過Western blot檢測三組細胞中β-catenin、E-cadherin及Vimentin的表達，發現FOXC1敲除組細胞系內β-catenin及Vimentin蛋白的表達明顯降低，E-cadherin蛋白的表達有增高，進一步驗證敲除FOXC1基因的宮頸癌細胞后，下調上皮-間轉化(EMT)過程中與轉移有關蛋白(β-catenin、Vimentin)的表達，并增加鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達，使其侵襲及轉移能力隨之下降。由此可見，FOXC1和EMT在宮頸癌發展過程中有一定作用，其異常表達可能作為宮頸癌檢查新的標志物。

宮頸癌是女性非常常見的婦科癌癥之一，現全世界范圍內每年仍有超過30萬人因此病死亡[2]，當前形勢下其具體病因及發病機制仍不明確。臨床上，宮頸癌的進展是從局部浸潤、侵犯周圍器官及淋巴結轉移與遠處轉移，其特點是早期可發生淋巴結及遠處轉移。據報道，無淋巴轉移的宮頸癌患者5年生存率為82.3%，有淋巴轉移的5年生存率為50.8%[15]。因此，控制腫瘤的侵襲轉移是提高宮頸癌患者生存率的主要方法之一[16-17]。腫瘤的基因靶向治療是未來癌癥治療的主要手段，在不久的將來，相信FOXC1有望成為宮頸癌治療的新靶點。