基于多指標成分同時測定的十七味大活血膠囊溶出行為比較研究

朱應成，徐斌，劉亮鏡，余靜

蕪湖市中醫醫院制劑中心，安徽 蕪湖 241000

溶出度是指固體藥物制劑在規定溶劑中溶出的速度和程度。中藥口服固體制劑的溶出度與藥物的質量優劣、生產工藝等因素密切相關[1]，體外溶出度試驗已成為評價固體制劑內在品質的重要手段[2]，合理的溶出度試驗可有效反映制劑的內在品質[3]。目前中藥固體制劑的溶出度研究報道較少，可能與中藥制劑組方藥味多、成分復雜、作用途徑尚不明確等監控難點有關。

十七味大活血膠囊（皖藥制字Z20050027）是蕪湖市中醫醫院院內制劑，由協定處方大活血Ⅰ號方開發而成，具有活血化瘀、消腫止痛功效。該制劑由丹參、赤芍、牡丹皮、紅花、延胡索、大黃等17味中藥組成，主要用于治療骨傷初期及手術后肢體腫脹、疼痛等。前期研究建立的十七味大活血膠囊質量標準中含量測定指標較少，且無溶出度檢查項[4]。本研究增加含量檢測指標，運用HPLC同時測定十七味大活血膠囊中芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚的含量，并在中藥丸劑溶出度相關研究[5]基礎上，對比十七味大活血膠囊中3個指標成分在純化水、人工胃液、人工腸液3種不同溶出介質中的體外溶出情況，采用相似因子法比較相同活性成分在不同溶出介質中的溶出度，及不同成分在同一溶出介質中的溶出度，并采用自定義加權系數整合模型評價十七味大活血膠囊在不同溶出介質中的整體溶出情況，從一定程度上預測該制劑的體內溶出情況，提高和完善其質量標準。

1 儀器與試藥

Agilent1200型高效液相色譜儀（含UV檢測器，美國安捷倫公司），XP-205、AL-204型電子分析天平（十萬分之一、萬分之一，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司），KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），RCZ-8M型溶出試驗儀（天津市天大天發科技有限公司）。

十七味大活血膠囊（自制，批號分別為20201101、20201102、20201201）；對照品芍藥苷（批號110753-201314）、丹酚酸B（批號111562-201212）、丹皮酚（批號110821-201112），中國食品藥品檢定研究院，純度均不小于95%；胃蛋白酶（批號20151201，酶活力≥3 000 U/g）、胰蛋白酶（批號20151201，酶活力≥1 000 U/g），上海展云化工有限公司；甲醇、乙腈和甲酸為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚含量測定

2.1.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A；10～25 min，10%～20%A；25～40 min，20%～28%A；40～50 min，28%～50%A），流速1.0 mL/min，檢測波長分別為芍藥苷230 nm（0～22 min）、丹酚酸B 286 nm（22～40 min）、丹皮酚274 nm（40～50 min），進樣量10 μL，柱溫20 ℃。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對照品溶液

精密稱取芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚對照品適量，分別加甲醇溶解并制成濃度為310.8、438.1、1 023.0 μg/mL的對照品貯備液；分別取芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚對照品貯備液4、3、1 mL共同置于10 mL容量瓶，加甲醇稀釋，得到芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚濃度分別為124.32、131.43、102.30 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2.2 供試品溶液

取十七味大活血膠囊內容物適量，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率350 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.1.2.3 陰性對照溶液

按十七味大活血膠囊處方和制備工藝，制備不含赤芍、丹參、牡丹皮的陰性樣品，按“2.1.2.2”項下方法制備，即得。

2.1.3 系統適用性與專屬性試驗

精密吸取“2.1.2”項下3種溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，結果見圖1。供試品色譜中，在與各對照品色譜峰相應保留時間處有吸收峰，各待測成分與相鄰色譜峰分離度均大于1.5，而陰性對照未見相應待測成分色譜峰。

圖1 十七味大活血膠囊中3種成分HPLC圖

2.1.4 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液1、2、4、8、10、15 μL，依次注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。以對照品濃度為橫坐標，色譜峰峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算3種成分的回歸方程和線性范圍，結果芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚在各自的范圍內線性關系良好，見表1。

表1 3種成分線性關系考察結果

2.1.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，結果芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚峰面積RSD分別為0.8%、0.2%、0.3%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄色譜圖，結果芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚峰面積RSD分別為0.9%、0.9%、0.3%，表明供試品溶液中的3種成分在24 h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗

分別平行取十七味大活血膠囊內容物（批號20201101）約1 g，共6份，精密稱定，按“2.1.2.2”項下方法制得6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，用外標法計算各成分的含量，結果芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚的平均含量分別為4.23、4.25、2.57 mg/g，RSD分別為0.6%、1.6%、1.3%，表明本方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗

取已知含量的十七味大活血膠囊（批號20201101）6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置于6個50 mL錐形瓶中，加入各對照品適量，精密加入70%甲醇50 mL，按“2.1.2.2”項下方法制備，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，結果芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚的平均加樣回收率分別為100.5%、99.6%、100.6%，RSD分別為1.8%、1.4%、1.9%。

2.1.9 樣品含量測定

稱取3批十七味大活血膠囊樣品（批號20201101、20201102、20201201），按“2.1.2.2”項下方法制備，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，用外標法計算各成分含量，結果見表2。

表2 3批十七味大活血膠囊樣品中3種成分含量測定結果（mg/g）

2.2 不同溶出介質中的溶出行為比較

2.2.1 溶出介質制備

①水：純化水。②人工胃液：取稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL、胃蛋白酶10 g，搖勻后加水稀釋成1 000 mL，即得[6]130。③人工腸液：即磷酸鹽緩沖液（含胰酶，pH 6.8），取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.8，另取胰酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL，即得[6]425。

2.2.2 供試品溶液制備

按2020年版《中華人民共和國藥典》（四部）溶出度測定法小杯法[6]132，以超聲脫氣的250 mL超純水為溶出介質，轉速75 r/min，待溫度穩定在（37.0±0.5）℃，取同批十七味大活血膠囊12粒，投入溶出儀中，分別于5、15、25、35、45 min取樣2 mL，過0.45 μm濾膜，得到以超純水為溶出介質的供試品溶液，同時向杯中補充相同溫度和體積的超純水。同法得到以人工胃液和人工腸液為溶出介質的供試品溶液。

2.2.3 溶出度測定及溶出曲線整合模型建立

取“2.2.2”項下供試品溶液，進樣測定，采用外標法計算芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚在不同溶出介質中不同時間點的溶出量。將已測得的該制劑中3種成分的平均含量按標示裝量換算值作為最大溶出量（100%），通過計算得到各時間點的相對累積溶出度。以相對累積溶出度為縱坐標，溶出時間為橫坐標，繪制相對累積溶出曲線。將權重系數（ωi）定義為制劑中某一成分含量（Ci，累積溶出度）占3種成分總含量（C）的比值，即ωi＝Ci/（C1＋C2＋C3），計算得到芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚自定義權重系數分別為0.37、0.39、0.24。計算十七味大活血膠囊在純化水、人工胃液、人工腸液中不同時間點的整合累積溶出度（Dt）。Dt＝ω1×C1＋ω2×C2＋ω3×C3。同一成分在不同溶出介質中的相對累積溶出曲線及整合模型見圖2，同一溶出介質中3種成分及整合模型的相對累積溶出曲線見圖3。

圖2 十七味大活血膠囊中3種成分及整合模型累積溶出曲線

圖3 十七味大活血膠囊在不同溶出介質中的累積溶出曲線

2.2.4 不同溶出介質中溶出曲線相似性評價

根據國家食品藥品監督管理總局《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》[7]，采用相似因子（f2）法比較溶出曲線的相似度。，式中，Rt和Tt分別為參比樣品和受試樣品在時間t的溶出量，n為時間點個數。若f2≥50則認為該2條溶出曲線相似，反之則認為不相似；f2越接近100則相似程度越高，越接近0則相似程度越低[8]。通過計算相同活性成分及多成分整合模型在純化水、人工胃液、人工腸液中溶出曲線f2，衡量各活性成分及整合模型在不同溶出介質中溶出曲線的相似度，結果見表3。通過計算在同一溶出介質中不同活性成分的溶出曲線f2，衡量不同活性成分在同一溶出介質中溶出曲線的相似度，結果見表4。

表3 不同溶出介質中十七味大活血膠囊中3種成分溶出行為相似度（f2）

表4 十七味大活血膠囊中3種成分在不同介質中的溶出行為相似度（f2）

3 討論

十七味大活血膠囊的君藥丹參及臣藥赤芍、牡丹皮均具有活血功效，與該制劑活血化瘀、消腫止痛的功效相吻合，因此，本試驗選取丹參、赤芍、牡丹皮的主要活性成分丹酚酸B、芍藥苷、丹皮酚作為含量測定指標。此外，為保證各待測成分在檢測波長處均為最大吸收，采用波長切換法[9-11]，并參考藥典將檢測波長設定為230 nm測定芍藥苷（0～22 min）、286 nm測定丹酚酸B（22～40 min）、274 nm測定丹皮酚（40～50 min），從而準確測定各成分含量。

西藥膠囊劑溶出度測定常使用900 mL溶出介質。經測定，每粒十七味大活血膠囊（0.35 g/粒）含芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚的總量分別為1.47、1.53、0.92 mg，若使用900 mL溶出介質，在成分全部溶出的情況下其濃度也僅為1.0～1.7 μg/mL，而溶出試驗起始階段溶出介質中藥效成分濃度更低，檢測結果難以準確體現其溶出趨勢，故本試驗選擇該制劑的日最大服用量12粒（3次/d，3～4粒/次）作為樣品用量，溶出介質用量選擇250 mL，并采用2020年版《中華人民共和國藥典》（四部）溶出度測定法第三法（小杯法）考察其溶出行為。

十七味大活血膠囊中同一成分及多成分整合模型在人工胃液與人工腸液中的溶出曲線f2均大于60，且與純化水比較，在人工胃液、人工腸液中的溶出曲線f2均小于45，表明十七味大活血膠囊在人工胃液、人工腸液中的溶出行為相似。結合溶出曲線可以看出，十七味大活血膠囊在人工胃液、人工腸液中的溶出速度及程度均明顯高于純化水。在同一溶出介質中，芍藥苷與丹皮酚的溶出曲線f2均大于85，且二者與丹酚酸B的溶出曲線f2為48～66，丹酚酸B顯示出不同于芍藥苷、丹皮酚的溶出行為，可能與丹酚酸B自身的化學穩定性有關。有研究顯示，丹酚酸B的化學穩定性差、易降解[12]，且丹參飲片在煎煮溶出過程中，隨煎煮時間延長，丹酚酸B的含量逐漸降低，同時丹參素、原兒茶醛等其他丹參酚酸類成分含量持續增加[13]。十七味大活血膠囊中丹酚酸B的溶出轉化情況有待進一步研究。

本研究建立了HPLC同時定量測定十七味大活血膠囊中芍藥苷、丹酚酸B、丹皮酚含量的方法，并比較了3種成分在不同溶出介質中的溶出行為。中藥制劑存在成分復雜、作用靶點不明確、作用途徑不確定等特點，該制劑中丹參成分迷迭香酸、丹參酮ⅡA，大黃成分大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素，延胡索成分延胡索乙素，桃仁成分苦杏仁苷，以及陳皮成分橙皮苷等未能檢測到，可能由于這些成分在制劑中含量較低，或化學分析條件受限。今后可繼續優化色譜條件，采用化學指紋圖譜法結合物質轉移規律研究，以期更好控制十七味大活血膠囊的質量。