電針對肝郁脾虛型慢性疲勞綜合征大鼠血清炎癥因子及腸道菌群的影響

謝亞娜，嵇波，張琴，牟秋杰，趙國禎，劉翼天，石天宇，徐塽，韓娜娜，劉玉婷，張靖宇，葛云鵬

1.北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京 100029；2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010

慢性疲勞綜合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是一種多系統功能障礙性疾病，以顯著而持久的疲勞為主要特征，伴運動能力下降、認知障礙、焦慮、抑郁等表現[1-2]。據統計，全球CFS患病率為0.89%[3]，中國CFS患病率為12.21%[4]。CFS存在嚴重致殘性，可致27%CFS患者完全喪失勞動能力，35%～69%CFS患者無法正常工作[1，5]。目前，針對CFS的西醫藥物和運動治療均存在作用局限、不良反應常見、安全性未知等問題[6-7]。研究表明，電針治療能有效改善CFS患者的疲勞癥狀、認知功能、焦慮和抑郁情緒，提高CFS患者生存質量并有良好的安全性[8-10]。

CFS的發生與機體免疫炎性反應密切相關[11]。已有研究發現，CFS患者血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）過表達[11-13]，細菌內毒素成分脂多糖釋放增加[13-14]，腸道菌群厚壁菌門、變形菌門等豐度改變[14]。TNF-α是介導免疫炎性反應的重要因子[15]，脂多糖是免疫信號的強力激活劑[16]，腸道菌群可調節免疫功能，參與炎性反應發生[17]。本實驗通過觀察電針“足三里”“合谷”“太沖”對肝郁脾虛型CFS模型大鼠行為學、血清TNF-α和脂多糖水平及腸道菌群門豐度的影響，探討“足三里”“合谷”“太沖”配穴對肝郁脾虛型CFS的治療效應及可能的調節機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF級雄性SD大鼠18只，10周齡，體質量（375±25）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（浙）2019-0001。飼養于北京中醫藥大學動物實驗中心，室溫（24±1）℃，相對濕度50%～60%，12 h晝夜節律，自由飲食進水，適應性喂養1周。將大鼠隨機分為對照組、模型組和電針組，每組6只。本實驗經北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（BUCM-4-2019090101-3041）。實驗過程中對動物的處理嚴格遵循2006年中華人民共和國科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》規定。

1.2 主要試劑與儀器

烏來糖（上海國藥試劑集團，批號20180308），瓊脂糖（美國Bio-rad公司，批號1613102），大鼠脂多糖、TNF-α酶聯免疫吸附法檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，貨號分別為m1856951-J、m1002859-J），磁珠法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，貨號DP712），TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒（美國Illumina公司）。0.20 mm×13 mm華佗牌一次性針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司），二導HAN’S穴位刺激儀（北京華衛產業開發有限公司，型號LH202H），動物行為軌跡分析系統（美國Plexon公司，型號CinePlex），動物行為學采集分析軟件（荷蘭NOLDUS公司，型號EthoVision XT），酶標儀（美國Molecular Devices公司，型號Spectra MAX M2），PCR儀（美國Bio-rad公司，型號Bio-rad T100），藍色熒光定量系統（美國Promega公司，型號QuantiFluorTM-ST），熒光儀（美國Thermo Fisher公司，型號Qubit 2.0），生物分析儀（美國Agilent公司，型號2100），高通量測序平臺（美國Illumina公司，型號NovaSeq 6000）。

1.3 造模

參照文獻[18-19]并改進，采用強迫游泳、慢性束縛和飲食控制方法制備肝郁脾虛型CFS大鼠模型。大鼠每日于水深45 cm、水溫（26±1）℃圓桶內強迫游泳15 min，束縛袋束縛3 h，2種應激方法隨機交替施加，避免產生適應性，同時飲食控制（單日進食、雙日禁食），持續造模21 d。以大鼠萎靡嗜臥、食欲減退、易激惹、便溏伴造模后負重力竭游泳、礦場實驗和高架十字迷宮表現明顯削弱為模型成功標準。

1.4 干預

造模同時進行電針治療。參照《實驗針灸學》[20]選取大鼠雙側“足三里”“合谷”“太沖”。“太沖”“合谷”直刺約2 mm，“太沖”連接電針負極，“合谷”連接電針正極；“足三里”直刺約7 mm，連接電針負極，并于“足三里”下2 mm處淺刺入皮下，連接電針正極。頻率2 Hz/15 Hz，強度1 mA，每次20 min，每日1次，共21 d。對照組和模型組給予同等條件束縛。

1.5 指標檢測

1.5.1 曠場實驗

第22日，將大鼠放置在開闊箱中央，箱上方安置攝像機，攝像機與計算機相連，記錄分析大鼠在箱內3 min移動總路程和平均速度，以此評估大鼠在陌生環境中自發運動能力。

1.5.2 高架十字迷宮實驗

第22日，將大鼠面向開放臂放置在十字迷宮中央格內，記錄5 min內大鼠開放臂進入次數和停留時間，以此評估大鼠焦慮樣表現。

1.5.3 負重力竭游泳

第23日，將大鼠置于水深45 cm、水溫（26±1）℃圓桶內進行負重游泳，使用秒表記錄力竭游泳時間，以此評估大鼠體力和疲勞情況。大鼠負重標準：體質量5%～10%；力竭判斷標準：頭部沉入水下10 s，不能上浮。

1.5.4 腫瘤壞死因子-α和脂多糖含量檢測

行為學實驗結束后，20%烏拉坦（1 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 500 r/min離心15 min，取上層血清進行ELISA檢測，所有操作均按照試劑盒說明書進行。

1.5.5 16S rDNA測序

大鼠麻醉取血，取結腸新鮮內容物置于無菌凍存管，-80 ℃冰箱保存。檢測時對樣本基因組DNA進行提取、稀釋，使用帶Barcode特異引物擴增目標區域16S V3～V4區（341F-806R），上游341F 5’-CCTAY GGGRBGCASCAG-3’，下游806R 5’-GGACTACNN GGGTATCTAAT-3’，PCR擴增、定量檢測及純化，將純化的擴增產物等量混合，連接測序接頭，使用建庫試劑盒進行文庫構建，經Qubit定量和Agilent質檢合格后，使用NovaSeq 6000進行上機測序形成OTU，基于OTU的絕對豐度進一步獲得各組腸道菌群門分類水平上各物種的相對豐度，以百分比表示。

1.6 統計學方法

采用SAS9.4統計軟件進行分析，Graphpad Prism 8.4.0軟件繪制統計圖。計量資料以±s表示，滿足正態分布且方差齊時用方差分析，兩兩比較用LSD法，方差不齊用Welch檢驗；非正態分布用Wilcoxon秩和檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針對模型大鼠自發運動能力的影響

與對照組比較，模型組大鼠曠場活動總路程和平均速度明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠曠場活動總路程和平均速度明顯增加（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠曠場實驗結果比較（±s，每組6只）

2.2電針對模型大鼠焦慮樣表現的影響

與對照組比較，模型組大鼠開放臂進入次數和停留時間均明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠開放臂進入次數和停留時間均明顯增加（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠高架十字迷宮實驗結果比較（±s，每組6只）

2.3 電針對模型大鼠負重力竭游泳時間的影響

與對照組比較，模型組大鼠負重力竭游泳時間明顯縮短（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠負重力竭游泳時間明顯延長（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠負重力竭游泳時間比較（±s，每組6只）

2.4 電針對模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α、脂多糖含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、脂多糖含量增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠血清TNF-α、脂多糖含量減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組大鼠血清TNF-α、脂多糖含量比較（±s，每組6只）

2.5 電針對模型大鼠腸道菌群門水平豐度的影響

在門分類水平上，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、螺旋體門和放線菌門是主要優勢菌群。與對照組比較，模型組大鼠腸道厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門豐度下降，變形菌門和螺旋體門豐度升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，電針組大鼠腸道厚壁菌門和放線菌門豐度升高，變形菌門和螺旋體門豐度下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

3 討論

根據臨床表現，CFS可歸屬中醫學“虛勞”“郁證”等范疇，病位多涉及肝、脾兩臟，臨床常見肝郁脾虛證型[21-22]。《素問·痿論篇》有“肝主身之筋膜，脾主身之肌肉”，強調肝脾與人的精神情志和肌肉筋膜運動密切相關，而精神情志、肌肉筋膜運動變化與CFS臨床癥狀的發生發展聯系緊密[23]。《通玄指要賦》言“三里卻五勞之羸瘦”，認為足三里能補中益氣，改善疲勞。《針灸穴名解》有“合谷、太沖各兩穴，名為四關，以其能大開通也”，認為合谷、太沖同用能調治氣血、疏理氣機，是解郁安神要穴。研究發現，針刺“足三里”“合谷”“太沖”可健脾解郁、扶正培元，顯著改善CFS模型小鼠的心理及軀體疲勞癥狀[24]。因此，本實驗選用電針“足三里”“合谷”“太沖”三穴。

本實驗通過模擬人類生活中生理及心理應激、飲食不節現象，建立肝郁脾虛型CFS大鼠模型。結合行為學實驗及模型組大鼠隨著造模推進出現的倦怠、嗜臥、食欲減退、大便稀溏、易激惹等表現，與臨床上肝郁脾虛型CFS患者表現出的乏力、氣短神疲、急躁易怒、緊張焦慮、納呆、便溏等癥狀較為接近，提示造模有效。

負重力竭游泳時間是反映大鼠體力狀態的經典指標，用以評價大鼠的疲勞情況。本實驗結果表明，模型組大鼠負重力竭游泳時間明顯縮短，表現為體力下降、易疲勞。電針組大鼠負重力竭游泳時間明顯延長，提示電針“足三里”“合谷”“太沖”能增強CFS大鼠體力并改善疲勞。曠場實驗是反映大鼠在陌生環境中自發活動行為的經典實驗方法，用以評估大鼠運動能力。本實驗發現，模型組大鼠曠場活動總路程和平均速度明顯減少，表現為運動能力下降，與臨床上CFS患者的運動能力降低相一致[2]。電針組大鼠曠場活動總路程和平均速度明顯增加，提示電針“足三里”“合谷”“太沖”能提高CFS大鼠的運動能力。高架十字迷宮是反映大鼠緊張情緒的經典行為學實驗，用以評估大鼠的焦慮狀態。模型組大鼠開放臂進入次數和停留時間減少，表現為明顯焦慮。電針組大鼠開放臂進入次數和停留時間明顯增加，提示電針“足三里”“合谷”“太沖”具有抗焦慮樣作用。

免疫炎性反應是機體移除有害刺激，促進損傷修復的保護性措施，應答過度可導致機體細胞、器官等功能受損，介導疾病產生。研究發現，CFS患者免疫系統功能發生紊亂，血液中多種細胞因子水平失衡[12]。TNF-α是免疫系統中重要的促炎細胞因子，可誘導細胞凋亡，參與炎性反應的病理過程[15]。TNF-α過表達可降低機體免疫功能，促使炎性介質或其他細胞因子爆發式增長，加劇機體炎性反應，導致多系統功能損傷[25-26]。研究發現，TNF-α過表達與脂多糖介導的免疫激活密切相關[13，16，27]。脂多糖存在于革蘭陰性菌外膜中，是一種炎性反應誘導劑[16，28]。根據促炎效力，脂多糖可分為激動性、弱激動性和拮抗性三類，其中激動性脂多糖的釋放與變形菌門變化相關，可以刺激免疫細胞活化，上調TNF-α表達[13，16，27，29-30]。研究顯示，TNF-α與脂多糖共同參與CFS患者體內免疫炎性反應，二者含量遞增與CFS患者臨床癥狀（疲勞、情志改變等）變化緊密相關[11-13]。本實驗結果表明，模型組大鼠血清TNF-α、脂多糖含量增加，與既往研究一致[11-14]。電針后，大鼠血清TNF-α、脂多糖含量減少，提示電針“足三里”“合谷”“太沖”改善肝郁脾虛型CFS模型大鼠癥狀是通過下調大鼠血清TNF-α、脂多糖水平，抑制炎性反應發揮作用。

腸道內菌群水平改變可影響機體免疫器官發育或介導機體炎性反應發生，從而影響宿主健康。CFS患者腸道菌群厚壁菌門豐度下降，變形菌門豐度升高，這種改變可能與CFS患者腸道內促炎性物種增加，抗炎性物種減少相關[14]。本實驗中，模型組大鼠腸道厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門豐度下降，變形菌門和螺旋體門豐度升高，與既往研究變化趨勢相似[14]；電針組大鼠厚壁菌門和放線菌門豐度升高，變形菌門和螺旋體門豐度下降。由于3組間門水平物種豐度變化差異無統計學意義，故尚不能認為電針“足三里”“合谷”“太沖”改善肝郁脾虛型CFS大鼠癥狀是通過調節腸道菌群門水平豐度變化發揮作用的。

綜上所述，電針“足三里”“合谷”“太沖”能增強肝郁脾虛型CFS大鼠運動能力，改善疲勞狀態和焦慮情緒，其機制可能與下調血清TNF-α及脂多糖水平、抑制炎性反應有關，但尚不能認為與調節腸道菌群門水平豐度相關。今后可深化腸道菌群種屬和代謝水平的研究，以期挖掘腸道菌群免疫介導作用與CFS之間的關系。