活血榮絡方對腦缺血再灌注損傷大鼠PINK1/Parkin信號通路的影響

顏思陽，楊仁義，劉利娟，郭純，尹倩，張宇星，周德生

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

腦梗死又稱缺血性腦卒中，是腦動脈狹窄或閉塞、腦供血不足導致的腦組織壞死，具有高致殘率、致死率，是腦卒中死亡的首要原因[1]。近年來，我國缺血性腦卒中發病率、患病率持續升高[2]。恢復缺血腦組織血液供應是急性缺血性腦卒中治療的主要措施，但快速再灌注可對腦功能造成損傷，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）[3]，CIRI病理生理過程較為復雜，近年來發現線粒體自噬在CIRI過程中發揮重要作用[4]。PTEN誘導激酶1（PINK1）和帕金蛋白（Parkin）在CIRI過程中可啟動線粒體自噬，特異性清除受損線粒體，保護組織免受損傷[5]。故研究PINK1/Parkin在CIRI過程中的表達及調控，對缺血性腦卒中的治療具有重要意義。

腦梗死屬中醫學“中風”范疇。課題組在腦藏象理論指導下提出缺血中風之榮氣虛滯病機體系[6-7]，認為榮氣為一切精微物質的總稱[8]，并將線粒體的生理、病理與榮氣理論相聯系，榮氣的物質屬性相當于現代醫學的線粒體，而線粒體功能可體現榮氣的作用[9]。基于榮氣虛滯理論創制的活血榮絡方是湖南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，臨床應用10余年，療效顯著。前期研究發現，活血榮絡方能減輕CIRI，減少線粒體活性氧（ROS）產生，降低線粒體鈣超載等[10]，但其對CIRI過程中線粒體自噬的調節機制還有待明晰。因此，本研究通過建立CIRI大鼠模型，

以PINK1/Parkin通路為切入點，從線粒體自噬角度探討活血榮絡方干預CIRI的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠40只，12～15周齡，體質量250～280 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心，溫度21～26 ℃，濕度40%～50%，通風良好，晝夜交替光照。分籠、標準飼料喂養，適應性飼養7 d后用于實驗。本研究經湖南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會審查批準（20201010-13）。

1.2 藥物及制備

活血榮絡方（雞血藤30 g，石楠藤30 g，生地黃15 g，玄參10 g，黃精15 g，乳香10 g，沒藥10 g，川芎10 g），飲片購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院張裕民主任藥師鑒定符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）規定。上述飲片加10倍量水浸泡12 h，加熱回流2 h，過濾，殘渣加8倍量水，加熱回流1 h，過濾，合并2次濾液，旋轉蒸發儀濃縮，得活血榮絡方浸膏，無菌玻璃瓶分裝，4 ℃冰箱保存備用，使用時蒸餾水稀釋至濃度約1.17 g/mL。雷帕霉素（美國Selleck公司，貨號S1039），按說明書配制為0.5 mg/mL的溶液，-80 ℃冰箱保存。

1.3 主要試劑與儀器

RIPA裂解液、JC-1線粒體膜電位（MMP）檢測試劑盒，貨號分別為P0013B、C2006，上海碧云天生物技術有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、線粒體提取試劑盒，貨號分別為P0100、SM0020，北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，貨號70-PQ0012，杭州聯科生物技術股份有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，貨號CW0022S，北京康為世紀生物科技股份有限公司；PINK1、Parkin、LC3B、p62、TOMM20、山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG，貨號分別為ab23707、ab77924、ab48394、ab91526、ab186735、ab6721、ab6789，英國Abcam公司；RT First Strand cDNA Synthesis Kit、RNA提取液、2×SYBR Green qPCR Master Mix（Low ROX），貨號分別為G3330、G3013、G3321，武漢賽維爾生物科技有限公司。大鼠栓線（型號2636A4、2638A4，北京西濃科技有限公司），透射電子顯微鏡（型號Tecnai G2 Spirit BioTWIN，美國FEI公司），石蠟切片機（型號HM325，美國Thermo Scientific公司），顯微成像系統（型號BA410E，中國Motic公司），低溫高速離心機（型號Fresco17，美國Thermo Scientific公司），化學發光凝膠成像分析儀（型號ChemiDocTMXRS＋，美國Bio-Rad公司），小型垂直電泳槽（型號1658001，美國Bio-Rad公司），熒光定量PCR儀（型號C1000 TouchTMThermal Cycler，美國Bio-rad公司），超微量分光光度計（型號NanoDrop2000，美國Thermo Scientific公司），超凈工作臺（型號SW-CJ-1FD，蘇州蘇凈安泰），多功能酶標儀（型號Enspire，美國Perkinelmer公司），超純水儀（型號Milli-QIQ-7000，美國Millipore公司）。

1.4 造模、分組及給藥

40只大鼠隨機分為假手術組、模型組、活血榮絡方（HXRLF）組和自噬激活劑（RAP）組，每組10只。模型組、HXRLF組、RAP組參考文獻[11]，采用大腦中動脈阻塞/再灌注法制備CIRI大鼠模型：鈍性分離大鼠右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA），從距ECA與ICA分叉部約4 mm處45°剪口進栓線，插入栓線約18 mm梗阻右側大腦中動脈，梗阻2 h后拔出栓線進行再灌注。假手術組僅分離CCA、ECA、ICA，不插入栓線。采用Zea-Longa 5級評分法[11]對大鼠神經功能進行評分，評分1～3分大鼠納入后續實驗。HXRLF組分別于造模前36、12 h及造模后12 h灌胃活血榮絡方藥液11.7 g/kg，假手術組、模型組、RAP組予等體積蒸餾水灌胃；RAP組于再灌注同時予雷帕霉素溶液1.5 mg/kg腹腔注射[12-14]，假手術組、模型組、HXRLF組予等體積生理鹽水腹腔注射。

1.5 神經功能評分

再灌注24 h后，采用Zea-Longa 5級評分法[11]對大鼠神經功能進行評分，分值越高表明神經功能缺損越嚴重。0分：活動正常，提尾時兩前爪伸向地面，無神經缺損癥狀；1分：提尾時對側前肢不能完全伸直，爬行時向對側轉圈；2分：提尾時對側前肢屈曲內收，爬行時向對側轉圈；3分：站立不穩，爬行時向偏癱側跌倒；4分：有意識障礙，不能自發行走。

1.6 尼氏染色

再灌注24 h后麻醉大鼠，腹主動脈采血，經心臟灌注生理鹽水200 mL，以4%多聚甲醛溶液繼續充分灌注，斷頭，取缺血損傷側腦組織，于4%多聚甲醛中固定保存。腦組織經脫水、透明、浸泡、石蠟包埋、冠狀位切片、脫蠟、復水、尼氏染色等步驟后，光學顯微鏡下觀察每組切片5個不同視野，顯微成像系統獲取皮質區神經元尼氏染色圖像，采用Image J軟件處理，觀察大鼠皮質區完整神經元數量[15]。

1.7 超微結構觀察

大鼠斷頭取腦，冷凍臺上分離大鼠腦組織，取皮質區約1 cm3組織于4%戊二醛中固定，電鏡室包埋、檢測。

1.8 線粒體膜電位檢測

取100 mg皮質區腦組織，生理鹽水清洗，于2 mL EP管中剪碎，加入1 mL預冷的裂解緩沖液，冰上研磨20次；4 ℃梯度離心獲得線粒體沉淀，加入0.5 mL洗滌緩沖液重懸，再次梯度離心后獲得高純度線粒體沉淀；0.1 mL貯存緩沖液重懸；配制JC-1染色工作液和緩沖液，0.9 mL JC-1染色工作液中加入0.1 mL純化的線粒體，多功能酶標儀激發波長514 nm、發射波長529 nm檢測綠色熒光強度，激發波長585 nm、發射波長590 nm檢測紅色熒光強度，以紅綠熒光比值計算MMP。當MMP較高時，JC-1聚集在線粒體基質中，形成聚合物，呈紅色熒光；當MMP較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質中，此時JC-1為單體，產生綠色熒光。

1.9 免疫組化檢測

腦組織石蠟包埋，切片（5 μm），常規脫蠟、脫水、抗原修復、漂洗、封閉；分別滴加LC3B（1∶200）、p62（1∶200）、TOMM20（1∶100）一抗，4 ℃孵育過夜；PBS漂洗，滴加二抗，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片，于顯微鏡（×400）下觀察。陽性染色為棕黃或棕褐色。隨機選取5個視野，用Image J軟件分別計算LC3B、p62、TOMM20陽性表達的平均光密度。

1.10 Western blot檢測

取皮質區腦組織置于冰上，加入裂解液（裂解液∶PMSF＝100∶1）裂解，勻漿機充分研磨，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；各組取30 μg蛋白上樣，經SDS-PAGE、轉膜、5%脫脂牛奶室溫封閉，加入LC3B（1∶1 000）、p62（1∶2 000）、TOMM20（1∶2 000）、PINK1（1∶1 000）、Parkin（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜；洗膜3次，10 min/次，加山羊抗兔（1∶8 000）、山羊抗小鼠（1∶8 000）二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜后凝膠成像分析儀成像。使用Image J軟件統計蛋白灰度值，以目的蛋白與β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.11 RT-PCR檢測

取100 mg皮質區腦組織，加入1 mL Trizol，勻漿機充分研磨，提取總RNA，檢測RNA濃度及純度，反轉錄為cDNA。按PCR試劑盒說明書進行擴增，反應體系：2×qPCR Mix 7.5 μL，2.5 μmol/L基因引物1.5 μL，反轉錄產物2.0 μL，ddH2O 4.0 μL；反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，熔解曲線60～95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃（循環40次）。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.12 統計學方法

采用SPSS25.0統計軟件進行分析。實驗數據以±s表示，神經功能評分采用Mann-WhitneyU檢驗，其余指標比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 活血榮絡方對模型大鼠神經功能的影響

假手術組無神經功能缺損，與假手術組比較，模型組大鼠神經功能評分明顯升高，神經功能缺損嚴重，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，HXRLF組、RAP組大鼠神經功能評分明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠神經功能評分比較（±s，分）

表2 各組大鼠神經功能評分比較（±s，分）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別 只數 神經功能評分假手術組 10 0模型組 10 2.80±0.63**HXRLF組 10 2.40±0.52##RAP組 10 2.20±0.63##

2.2 活血榮絡方對模型大鼠皮質區神經元數量的影響

完整神經元經尼氏染色后在光鏡下呈藍紫色，可見尼氏小體包圍，見圖1。假手術組神經元結構形態正常。與假手術組比較，模型組大鼠尼氏小體數目明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01），表明完整神經元數量減少；與模型組比較，HXRLF組、RAP組大鼠尼氏小體數目增加，差異有統計學意義（P＜0.01），表明完整神經元數量增加。見圖2。

圖1 各組大鼠神經元結構（尼氏染色，×400）

圖2 各組大鼠皮質區尼氏小體數目比較（±s，每組5只）

2.3 活血榮絡方對模型大鼠皮質區超微結構的影響

透射電鏡結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠皮質區雙層膜結構的自噬小體數目增多；與模型組比較，HXRLF組和RAP組大鼠皮質區雙層膜結構的自噬小體數目明顯增多。見圖3。

圖3 各組大鼠皮質區超微結構（bars＝2 μm）

2.4 活血榮絡方對模型大鼠皮質區線粒體膜電位的影響

與假手術組比較，模型組大鼠皮質區MMP明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，HXRLF組和RAP組大鼠皮質區MMP明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組大鼠皮質區MMP比較（±s，每組5只）

2.5 活血榮絡方對模型大鼠皮質區LC3B、p62、TOMM20蛋白表達的影響

免疫組化及Western blot結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠皮質區LC3B、p62蛋白表達升高，TOMM20蛋白表達降低，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，HXRLF組、RAP組大鼠皮質區LC3B蛋白表達升高，p62、TOMM20蛋白表達降低，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5～圖8。

圖5 各組大鼠皮質區LC3B蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400，±s，每組5只）

圖8 各組大鼠皮質區p62、LC3B、TOMM20蛋白表達比較（±s，每組5只）

2.6 活血榮絡方對模型大鼠皮質區PTEN誘導激酶1、帕金蛋白蛋白和mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠皮質區PINK1、Parkin蛋白和mRNA表達升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，HXRLF組和RAP組大鼠皮質區PINK1、Parkin蛋白和mRNA表達升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖9、圖10。

圖6 各組大鼠皮質區p62蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400，±s，每組5只）

圖9 各組大鼠皮質區PINK1、Parkin mRNA表達比較（±s，每組5只）

圖10 各組大鼠皮質區PINK1、Parkin蛋白表達比較（±s，每組5只）

圖7 各組大鼠皮質區TOMM20蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400，±s，每組5只）

3 討論

腦梗死后局部腦缺血和再灌注引發的級聯反應可激活線粒體自噬。腦缺血發生后，腦血流急劇減少導致氧、糖缺乏，引起線粒體結構異常，氧化磷酸化發生障礙；再灌注期間，由氧供恢復引起的氧化應激反應是再灌注損傷的核心環節，而線粒體是其中的關鍵場所。CIRI過程中低氧、鈣超載等多種因素作用引起線粒體氧化磷酸化障礙、ROS生成增多、清除能力下降，導致ROS大量積累引發過度氧化應激，進一步加重線粒體損傷，而損傷的線粒體是加重CIRI的關鍵因素。因此，應及時清除受損或功能失調的線粒體。但目前對于線粒體自噬在CIRI過程中的作用仍存在爭議。Wang等[16]研究表明，在CIRI大鼠模型中，激活線粒體自噬改善了氧化應激誘導的線粒體功能損傷，減輕了神經功能損傷。而Shi等[17]研究表明，抑制線粒體自噬，可抑制自噬性細胞死亡。因此，進一步探究CIRI與線粒體自噬的關系，可為缺血性腦卒中的治療提供重要依據。

活血榮絡方基于榮氣虛滯理論創立而成，以雞血藤、石楠藤為君，生地黃、玄參、黃精為臣，佐以乳香、沒藥、川芎為使。全方雖有滋補肝腎之品，但不會滋膩妨礙氣血運行；雖有辛溫微燥之品，亦不致傷陰加重陰虛，而能鼓動氣血，促進活血化瘀之功；其有陰有陽，陰陽相互制約，又互根互用，以達陰陽平衡之態，切合線粒體自噬異常之病機[9]。LC3作為自噬標志蛋白，主要包括胞質中的LC3Ⅰ和自噬小體膜上的LC3Ⅱ，二者可相互轉化，LC3Ⅱ被認為是自噬形成的標志分子。p62可充當支架蛋白與LC3結合，進而被溶酶體降解，其表達通常與自噬水平呈負相關，即自噬水平升高時，p62表達降低，反之表達升高；當自噬小體與溶酶體形成受阻時，自噬小體降解受阻，LC3Ⅱ和p62會累積，可能出現p62與LC3Ⅱ表達同時升高[18-19]。線粒體膜蛋白TOMM20可反映線粒體含量變化，且在線粒體自噬激活時表達下調[20]。本研究結果表明，HXRLF組和RAP組大鼠神經功能評分顯著降低，神經元結構有所改善，自噬小體數量增加，MMP升高，p62、TOMM20蛋白表達降低，LC3B蛋白表達升高，提示活血榮絡方可能通過激活線粒體自噬以保護受損腦組織。

Wu等[21]研究表明，激活PINK1/Parkin通路可激活線粒體自噬，抑制細胞凋亡，保護神經細胞。PINK1是一種線粒體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可在線粒體外膜上募集OPTN、CALCOCO2/NDP52等自噬受體，而OPTN可與SQSTM1/p62形成復合物，共同調節選擇性自噬。Parkin是一種E3泛素連接酶，位于細胞質中，在線粒體降解中起重要作用，通常Parkin募集至受損線粒體需PINK1介導，其在線粒體外膜上積累以對線粒體損害作出響應，最終通過p62蛋白與LC3蛋白結合，使線粒體降解。本研究結果表明，活血榮絡方和雷帕霉素均可上調PINK1、Parkin蛋白及mRNA水平，激活線粒體自噬。

綜上，活血榮絡方可能通過激活PINK1/Parkin信號通路，激活線粒體自噬，減輕CIRI，本研究可為闡明活血榮絡方干預CIRI的機制提供實驗依據。