敦煌醫(yī)學古方大補脾湯對放射性肺損傷大鼠PI3K/Akt信號通路的影響

張朝寧，余臣祖

甘肅中醫(yī)藥大學，敦煌醫(yī)學與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

放射性肺損傷是胸部腫瘤放療不可避免的并發(fā)癥，包括放射性肺炎和放射性肺纖維化，發(fā)生率約為25%，不僅是限制放療的主要因素，還嚴重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。放射性肺損傷發(fā)生機制尚不明確，目前臨床無理想防治藥物，若不能盡早控制疾病進展，將會出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的放射性肺纖維化，最終導致患者呼吸衰竭甚至死亡[3]。研究表明，PI3K/Akt信號通路參與放射性肺損傷的發(fā)生，抑制Akt磷酸化，可抑制膠原蛋白沉積，減輕肺纖維化[4-6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，敦煌醫(yī)學古方大補脾湯可改善放射性肺損傷大鼠肺部病理損害，抑制多種與放射性肺損傷密切相關(guān)的細胞因子表達[7]，但是否與PI3K/Akt信號通路有關(guān)尚待研究。基于此，本實驗通過X射線照射大鼠右肺建立放射性肺損傷大鼠模型，觀察大補脾湯對模型大鼠PI3K/Akt信號通路的影響，進一步探討大補脾湯治療放射性肺損傷的作用機制，為敦煌醫(yī)學古方的推廣應用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠40只，2～3月齡，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SYXK（甘）2015-0003。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2 藥物及制備

大補脾湯（人參、炙甘草、干姜各15 g，白術(shù)、麥冬、五味子、旋覆花各5 g），飲片購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房，甘肅中醫(yī)藥大學中藥制藥實驗室煎制，濃縮至含原藥材1.214 g /mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號分別為ml003142、ml160611、ml038288、ml337631），免疫組化多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，貨號PC0020），DAB試劑盒、抗體稀釋液、免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號分別為ZLI-9018、ZLI-9028、SP9003），兔抗PI3K、Akt、p-Akt抗體（美國GeneTex，貨號分別為GTX111068、GTX121937、GTX128414），兔抗p-PI3K抗體（英國Abcam，貨號ab182651），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Fast qPCR試劑盒（上海翌圣，貨號分別為10606ES60、H4901030）。X射線輻射儀（美國Faxitron，型號RX650），實時定量PCR儀（美國Thermo，型號StepOne Plus），高速低溫臺式離心機（德國Eppendorf，型號TGL-16），PRO200型組織勻漿器（美國Bio-Gen公司），M-2016型石蠟切片機、TEC-VEM-J2型石蠟包埋機、VIP-5JR-J2型自動組織脫水機（德國Leica公司），恒溫培養(yǎng)箱（青島澳柯瑪股份有限公司，型號BC/BD-208HNE），電泳儀（北京六一生物，型號DYY-6D），搖床（德國IKA，型號SK-O180-E），酶標儀（美國Bio-Rad，型號iMark）。

2 實驗方法

2.1 分組及給藥

采用隨機數(shù)字表法將40只SD大鼠分為空白對照組、模型組、單次給藥組、兩次給藥組，每組10只。照射前單次給藥組、兩次給藥組每日予大補脾湯灌胃（按人與大鼠體表面積折算，大鼠每日給藥量約為成人的10倍，即12.14 g/kg），空白對照組和模型組每日予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)2周。照射后，兩次給藥組每日繼續(xù)予大補脾湯灌胃2周（劑量同前），其余各組予等量生理鹽水灌胃，給藥體積均為2.6 mL。

2.2 造模

參考前期研究中放射性肺損傷大鼠模型制備方法[7]，照射前10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，除空白對照組外，其余各組大鼠用X射線輻射儀單次照射右肺，鉛皮屏蔽身體其余部位。1 Gy/min，吸收劑量為8 Gy。

2.3 標本采集

照射后2周頸椎脫臼法處死大鼠，腹主動脈取血，12 000 r/min離心15 min，分離血清，按ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt含量。分離大鼠右肺，冰生理鹽水沖洗，分裝放入凍存管，-80 ℃冰箱凍存。行免疫組化檢測的右肺組織用4%多聚甲醛固定。

2.4 免疫組化檢測大鼠右肺組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達

取大鼠右肺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度4 μm），經(jīng)脫蠟、水化、修復后，封閉加PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗體，顯色、脫水、封片。用Olympus光學顯微鏡讀片拍照，BI-2000免疫組化分析軟件計算圖片平均灰度值，蛋白相對表達量用平均灰度值表示，灰度值越大，蛋白表達量越低。

2.5 qPCR檢測大鼠右肺組織PI3K、Akt mRNA表達

取大鼠右肺組織，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以cDNA為模板，進行qPCR。反應體系：SYBR Fast qPCR Mix（2×）10 μL，引物2 μL，cDNA 2 μL，加滅菌蒸餾水至20 μL；反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，40次循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成，并在GeneBank上核對證實，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.6 Western blot檢測大鼠右肺組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達

取200 mg大鼠右肺組織，提取總蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白變性后，經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交反應，最后曝光顯影觀察，采用Image J 6.0對條帶量化分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值計算目的蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，方差不齊用Dunnett’s檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 大補脾湯對模型大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，單次給藥組、兩次給藥組大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量比較（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) PI3K/（pg/mL） Akt/（μmol/L） p-PI3K/（pg/mL） p-Akt/（μmol/L）空白對照組 10 806.55±13.86 23.95±0.79 815.79±30.96 11.85±0.51模型組 10 881.55±15.31** 28.18±0.57** 942.98±49.00** 13.41±0.52**單次給藥組 10 829.17± 9.92# 25.29±0.86# 873.25±48.13# 12.53±0.55#兩次給藥組 10 795.04±16.82## 24.67±0.53## 829.39±40.03## 11.55±0.53##

4.2 大補脾湯對模型大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt陽性表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示，PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt在正常大鼠肺組織中表達較少，經(jīng)X射線照射后，在支氣管黏膜周圍表達增強，單次給藥組陽性表達減弱，兩次給藥組陽性表達減弱更為明顯。與空白對照組比較，模型組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，單次給藥組、兩次給藥組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表3、圖1。

圖1 各組大鼠右肺組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt陽性表達（免疫組化染色，×40）

表3 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt陽性表達比較（±s，平均灰度值）

表3 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt陽性表達比較（±s，平均灰度值）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) PI3K Akt p-PI3K p-Akt空白對照組 10 0.35±0.03 0.30±0.02 0.34±0.02 0.33±0.03模型組 10 0.21±0.02** 0.20±0.02** 0.22±0.02** 0.22±0.03**單次給藥組 10 0.29±0.02# 0.25±0.03# 0.29±0.02# 0.25±0.03#兩次給藥組 10 0.24±0.01## 0.21±0.02## 0.24±0.03## 0.22±0.04##

4.3 大補脾湯對模型大鼠右肺組織PI3K、Akt mRNA表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠右肺組織PI3K、Akt mRNA表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，單次給藥組、兩次給藥組大鼠右肺組織PI3K、Akt mRNA表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt mRNA表達比較（±s）

表4 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt mRNA表達比較（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) PI3K Akt空白對照組 10 1.00±0.05 1.00±0.06模型組 10 1.72±0.09** 1.75±0.14**單次給藥組 10 1.46±0.03# 1.20±0.04#兩次給藥組 10 1.10±0.05## 1.10±0.08##

4.4 大補脾湯對模型大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，單次給藥組、兩次給藥組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表5、圖2。

表5 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達比較（±s）

表5 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達比較（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) PI3K Akt 空白對照組 10 1.00±0.08 1.00±0.03 模型組 10 1.87±0.21** 1.92±0.06** 單次給藥組 10 1.46±0.16# 1.40±0.06# 兩次給藥組 10 0.85±0.07## 0.93±0.04## p-PI3K p-Akt1.00±0.08 1.00±0.08 1.44±0.02** 1.82±0.16**1.20±0.11# 1.50±0.15#0.95±0.08## 1.17±0.10##

圖2 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白免疫印跡圖

5 討論

當肺組織遭受電離輻射時，會引起肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞損傷或凋亡，誘導單核細胞、淋巴細胞和粒細胞發(fā)生一系列炎癥反應和趨化，聚集在組織損傷部位，進而導致大量炎癥因子、趨化因子和生長因子釋放，當這種損害持續(xù)時，最終會導致肺纖維化[8-9]。

PI3K/Akt信號通路參與肺組織損傷，在體外循環(huán)相關(guān)肺損傷大鼠模型中，PI3K/Akt信號通路通過介導細胞凋亡發(fā)揮作用[10-11]。PI3K存在于細胞中，通過磷酸化細胞膜上的家族成員，募集和激活下游一系列靶分子（如Akt），Akt是PI3K下游的重要激酶之一，Akt被活化后會參與中性粒細胞凋亡，通過調(diào)控Akt活性可抑制肺組織炎癥反應[12-13]。

此外，PI3K/Akt通路是介導肺纖維化的重要信號通路。Tsoyi等[14]發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路可抑制成纖維細胞激活，減輕放射線誘導的肺纖維化。脂多糖通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制自噬，促進肺成纖維細胞增殖，進而促進肺纖維化[15]。彭文潘等[16]發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路是陳皮治療肺纖維化的潛在作用通路之一。饒鴻宇等[17]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學研究發(fā)現(xiàn)，補肺活血膠囊通過PI3K/Akt等關(guān)鍵信號通路緩解患者肺纖維化程度。因而，PI3K/Akt信號通路可作為防治放射性肺損傷的作用靶點之一。

大補脾湯出自敦煌醫(yī)學卷子《輔行訣臟腑用藥法要》，主治脾氣大疲，飲食不消，時自吐利，其人枯瘦如柴，立不可動轉(zhuǎn)，口中苦，干渴，汗出，氣急，脈微而時結(jié)者。方中人參益氣生津，炙甘草、白術(shù)健脾益氣，干姜溫中散寒，麥冬益胃生津，五味子斂肺生津，旋覆花降逆止嘔。諸藥合用，共奏益氣生津、補脾益肺之功。

肺屬金，脾屬土，脾為肺之母臟，培土生金法是根據(jù)“虛則補其母”原則，通過補益脾氣而達到補益肺氣。大補脾湯切合胸部惡性腫瘤放療患者因射線導致的肺脾氣陰虧虛之病機特點，是培土生金理論的具體體現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，大鼠右肺受8 Gy X射線照射后，與空白對照組比較，模型組大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量明顯增加（P＜0.01），右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白及PI3K、Akt mRNA表達顯著上調(diào)（P＜0.01），表明PI3K/Akt信號通路表達異常，參與介導了放射性肺損傷的發(fā)生。與模型組比較，單次給藥組和兩次給藥組大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量明顯減少（P＜0.05，P＜0.01），右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白及PI3K、Akt mRNA表達顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），表明大補脾湯可抑制PI3K、Akt磷酸化，調(diào)控PI3K/Akt信號通路，從而發(fā)揮對放射性肺損傷大鼠的保護作用。其中，兩次給藥組大鼠各項指標變化更明顯，說明照射前和照射后兩次給藥療效最佳。

綜上所述，PI3K/Akt信號通路參與介導了放射性肺損傷的發(fā)生，大補脾湯通過抑制PI3K、Akt磷酸化，調(diào)控PI3K/Akt信號通路，發(fā)揮對放射性肺損傷的保護作用。