地黃飲子“異病同治”阿爾茨海默病和帕金森病網絡藥理學及分子對接研究

劉寧，劉毅，秦亞莉，韓誠，閆川慧，賀文彬

1.山西中醫藥大學附屬醫院，山西 太原 030024；2.山西中醫藥大學，山西 晉中 030619

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）和帕金森?。≒arkinson disease，PD）是神經退行性疾病的典型代表。目前認為，AD的病理特征是光鏡下腦神經細胞外出現β淀粉樣蛋白（β amyloid，Aβ）沉積形成的老年斑（senile plaques，SP）和細胞內Tau蛋白異常磷酸化，以及由此引發的神經元纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）和大腦新皮層及海馬突觸丟失、神經炎癥、神經細胞的死亡[1]；PD的發病機制傾向于黑質紋狀體多巴胺神經元的變性壞死，并且出現含有嗜酸性的路易小體[2]。中醫學認為，二者基本病機均為“腎虛髓空”，并據此指導臨床治療。本課題組前期研究顯示，地黃飲子干預AD和PD的方證效應機制可能與泛素蛋白酶體系統衰退有關[3]。

地黃飲子出自《圣濟總錄》，由熟地黃、巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉、附子、五味子、肉桂、茯苓、麥冬、石菖蒲、遠志共12味藥組成，有滋腎陰、補腎陽、化痰開竅之功。方中熟地黃、山茱萸滋陰填精益髓、滋補腎陰，肉蓯蓉、巴戟天溫腎壯陽，溫而不燥，四藥相配，陰陽并補，培補下元虛衰，共為君藥；附子、肉桂大辛大熱，益火助陽，協助肉蓯蓉、巴戟天補腎壯陽以溫下元，攝納浮陽并引火歸元，石斛、麥冬、五味子滋養肺腎，為臣藥；石菖蒲與遠志、茯苓合用，化痰開竅，為佐藥；另以姜、棗和中為使。全方陰陽雙補，上下同治，以培補下元虛衰之本為主，兼化痰開竅，可謂標本兼顧。中藥方劑具有多成分、多靶點、多通路發揮作用的特點，本研究通過網絡藥理學對地黃飲子“異病同治”AD、PD的相關生物學機制進行闡釋，為中醫“異病同治”理論提供依據。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分篩選及靶點匹配

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索熟地黃、巴戟天、山茱萸、肉蓯蓉、附子、五味子、肉桂、茯苓、石菖蒲的化學成分。通過中國知識資源總庫（CNKI，https://www.cnki.net/），主題檢索2015年1月1日－2020年12月1日文獻中遠志、石斛、麥冬的化學成分。通過SwissADME平臺（http://www.swissadme.ch/）篩選地黃飲子組方藥物有效成分，篩選條件：胃腸道吸收（GI absorption）為高（High）、血腦屏障滲透（BBB permeant）為是（Yes）、類藥性（Drug likeness）大于2個符合（Yes）。篩選出的有效成分結合TCMSP和SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）得到相關靶點，并通過UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）匹配靶點基因名。

1.2 疾病靶點獲取

通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/#）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數據庫分別檢索“Alzheimer Disease”“Parkinson’s Disease”，得到AD、PD相關疾病靶點，并將3個數據庫所得靶點分別合并、去重，再利用UniProt數據庫匹配已驗證的人類靶點基因名。

1.3 藥物-疾病交集靶點獲取

利用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）將地黃飲子藥物靶點分別與AD、PD相關疾病靶點取交集，獲得地黃飲子有效成分直接與疾病相關的靶點。

1.4 疾病-藥物-成分-靶點網絡及蛋白相互作用網絡構建

以疾病、地黃飲子、組方藥物、藥物有效成分及其相關靶點為節點，以各節點間相互關系為邊，利用Cytoscape3.8.0構建疾病-藥物-成分-靶點網絡，并根據網絡中節點的Degree值篩選關鍵成分。利用STRING數據庫（https://string-db.org/）構建藥物-疾病交集靶點蛋白相互作用（PPI）網絡，對PPI網絡進行拓撲分析以篩選關鍵靶點。

1.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將藥物-疾病交集靶點導入Cytoscape3.8.0的BiNGO、ClueGO插件，分別進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并進行可視化。

1.6 關鍵成分與關鍵靶點分子對接

選取疾病-藥物-成分-靶點網絡的關鍵成分及藥物-疾病交集靶點PPI網絡的關鍵靶點，分別在Zinc（https://zinc.docking.org/）、PDB（http://www.rcsb.org/）數據庫中獲取3D結構，并使用Vina進行分子對接，將其中對接最好的組合使用Pymol進行可視化。

2 結果

2.1 藥物有效成分和對應靶點

通過TCMSP、CNKI檢索及篩選，獲得地黃飲子有效成分127種（重復成分10種），其中熟地黃、巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉、附子、五味子、肉桂、茯苓、麥冬、石菖蒲、遠志分別為2、12、14、19、5、7、8、0、6、15、2、37種。結合SwissTargetPrediction，得到藥物靶點926個。

2.2 疾病靶點

通過GeneCards數據庫得到AD相關靶點9 554個、PD相關靶點7 657個，以相關度大于中位數進行篩選，分別獲得AD、PD靶點4 780、4 362個；此外，OMIM、TTD數據庫分別得到AD靶點305、29個，PD靶點367、23個。將以上所得靶點分別合并、去重，通過UniProt數據庫匹配已驗證過的人類靶點，共獲得AD疾病靶點4 523個，PD疾病靶點3 733個。

2.3 藥物-疾病交集靶點

將藥物靶點與疾病靶點取交集，獲得地黃飲子分別與AD、PD直接相關的交集靶點653、466個。

2.4 疾病-藥物-成分-靶點網絡和交集靶點蛋白相互作用網絡

利用Cytoscape3.8.0構建疾病-藥物-成分-靶點網絡，結果見圖1。網絡中Degree＞100的12個關鍵成分分別為槲皮素、l4-(4-羥基苯乙基)-2,6-二甲氧基苯、l3-O-甲基槲皮素、2-羥基-4,6-二甲氧基二苯甲酮、1,7-二甲氧基-2,3-亞甲基二氧雜蒽酮、4-(3,5-二甲氧基苯乙基)苯酚、對羥基苯乙基阿魏酸酯、N-對香豆酰酪胺、5-羥基-3,7-二甲氧基-1,4-菲醌、1,2,3,6,7-五甲氧基呫噸酮、激肽原A、甲基對苯二酚B。將藥物與AD、PD的交集靶點分別導入STRING數據庫構建PPI網絡，通過CytoNCA插件分析網絡并限定DC、BC、CC、NC、LAC值均大于等于4倍中位數，得到PPI核心網絡，網絡節點即關鍵靶點，見圖2。

圖1 地黃飲子治療AD、PD疾病-藥物-成分-靶點網絡

圖2 地黃飲子治療AD、PD交集靶點PPI網絡

2.5 GO和KEGG富集分析結果

將藥物-疾病交集靶點導入BiNGO，設定置信水平為0.01，進行GO富集分析，結果見圖3。GO生物過程（biological process）主要包括生物反應、對刺激的應答、細胞過程、信號過程、代謝過程等，GO分子功能（molecular function）包括結合、催化活動、分子轉運活動、電荷轉運活動等，GO細胞組分（cellular component）以細胞成分、突觸成分、細胞外域等為主。將交集靶點導入ClueGO，設定P value≤0.005、最小聚類為30、K-score為0.55，進行KEGG通路富集分析，結果見圖4。AD主要通路有TNF信號通路、神經營養信號通路、雌激素信號通路、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路等，PD主要通路有TNF信號通路、神經營養信號通路、甲狀腺激素信號通路、胰島素抵抗、流體剪切應力和動脈粥樣硬化。

圖3 地黃飲子治療AD、PD交集靶點GO富集分析結果關聯圖

圖4 地黃飲子治療AD、PD交集靶點KEGG通路富集分析結果

2.6 分子對接結果

關鍵靶點和關鍵成分分子對接結合能大多低于-5.0 kcal/mol，提示關鍵成分均可與關鍵靶點形成穩定結構，見表1。將對接結果最好的關鍵成分激肽原A與關鍵靶點PTGS2可視化，二者可通過疏水口袋形成對接，見圖5。

表1 地黃飲子治療AD、PD關鍵靶點與關鍵成分分子對接結合能（kcal/mol）

圖5 激肽原A與PTGS2分子對接構象圖

3 討論

“異病同治”是中醫辨證論治特有的治療法則，由于證候具有時相性和空間性的特征，一種證候可能存在于多種疾病中，故可以采用相同的方法進行治療。AD屬中醫學“呆病”“癡呆”范疇，PD屬中醫學“顫證”范疇，二者基本病機均為“腎虛髓空”[4]，其發病機制均與神經元凋亡、小膠質細胞的調節作用、miRNA表達、自噬過程的調節作用及P62蛋白的降解作用有密切關系[5]。因此，AD與PD的中醫證候和西醫病理機制均有共同點，采用相同方藥進行治療有其理論依據，本研究采用網絡藥理學和分子對接對其進行分析和驗證。

地黃飲子治療AD的臨床和基礎研究報道多以已知信號通路為切入點[6-8]。張麗等[9]采用地黃飲子治療AD患者60例，認為其作用機制可能與調節Notch1、ASAM10及BACE1蛋白，降低丙烯醛濃度有關。臨床使用地黃飲子治療PD有顯著療效[10]?，F有研究基本圍繞氧化應激展開，而針對異常蛋白狙擊和神經炎癥等研究很少，考慮地黃飲子可能通過抗氧化應激、抑制細胞凋亡、減輕神經免疫炎癥反應、抑制蛋白異常聚集、誘導自噬、改善線粒體能量代謝等方面發揮治療PD的作用[11]。

本研究通過網絡藥理學分析地黃飲子組方藥物有效成分及其作用靶點，得到該方治療AD和PD的相關信號通路為TNF信號通路和神經營養信號通路。研究顯示，神經營養因子（NTs）是一類調節神經元發育、分化及功能的因子，它可激活2種不同類型的受體，包括酪氨酸激酶的Trk家族和腫瘤壞死因子受體超家族中的p75NTR，進而啟動復雜的信號轉導通路，從而發揮生物學效應[12]。在神經退行性病變中，NTs在神經系統不同部位的表達水平與生理狀態下有顯著差異，提示NTs的表達與神經退行性變密切相關，如在AD中基底核的前腦基底膽堿能神經元神經生長因子（NGF）表達下降[13-14]，而在AD受累最嚴重的海馬區域額葉皮質區神經元NGF表達上升[15-16]，表現出與病理狀態相反的改變。與之不同的是，腦源性神經營養因子（BDNF）在海馬區、額葉皮質區和膽堿能神經元聚集區表達水平較高，并起到支持相應腦區神經元存活、促進神經生長及維持突觸可塑性的作用[17-18]。項捷[19]研究發現，BDNF減少后，TrkB與Tau相互作用是導致AD發病的重要原因。

NTs作為一個龐大家族，其中的保守性多巴胺神經營養因子家族在PD多巴胺神經元的修復中起到至關重要的作用。林瑤等[20]研究顯示，經補腎復方干預后，PD模型大鼠額葉、紋狀體的大腦多巴胺能神經營養因子（CDNF）、中腦膠質細胞源性神經營養因子（MANF）蛋白及mRNA表達水平升高，提示補腎復方可能通過增加不同腦區CDNF和MANF的表達發揮神經保護作用，從而防治PD。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學和分子對接技術闡釋地黃飲子“異病同治”AD和PD的分子生物學機制，可為中醫“異病同治”理論提供依據，并為AD和PD的精準治療提供研究思路。