T-SPOT.TB檢測在骨結核中的輔助診斷價值*

閆麗梅，王 靜，史 君，趙 靜，賈 鵬

1.內蒙古自治區人民醫院重癥醫學科，內蒙古呼和浩特 010050；2.內蒙古醫科大學附屬醫院風濕免疫科，內蒙古呼和浩特 010050；3.內蒙古醫科大學基礎醫學院生理教研室，內蒙古呼和浩特 010050；4.內蒙古自治區人民醫院骨科，內蒙古呼和浩特 010050

骨結核是肺外結核累及的主要部位，約占肺外結核的30%左右。骨結核是由結核分枝桿菌(MTB)感染骨、脊柱和關節所導致的疾病，通常發病隱匿，病程長，可影響骨骼的發育，容易致殘。骨結核中最常見的是脊柱結核，約占骨結核的50%，占全身結核的3%～5%[1]。臨床上診斷骨結核主要依據患者的臨床表現、影像學檢查、局部病灶的病理結果和MTB的培養。但由于MTB培養周期長、陽性率低，而病理診斷屬于有創檢查，使其臨床應用受到限制。因此，迫切需要新的檢測方法來提高骨結核的早期診斷率和準確性。

結核感染T細胞斑點(T-SPOT.TB)檢測是近年來輔助診斷結核感染的新免疫學方法，被廣泛使用于臨床[2]。T-SPOT.TB的檢測原理是采用MTB特異性抗原早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)和培養濾過蛋白10(CFP-10)肽段刺激T淋巴細胞，使其釋放γ干擾素(INF-γ)，使用酶聯免疫斑點法(ELISPOT)計數活化的效應性T淋巴細胞[3]。本文評價T-SPOT.TB檢測在骨結核輔助診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2013-2017年內蒙古自治區人民醫院和內蒙古醫科大學附屬醫院送檢的疑似骨結核患者的外周靜脈血標本212例，其中男110例、女102例，平均年齡(54.06±14.76)歲。根據臨床表現、影像學檢查、細菌學、組織病理學等診斷分為骨結核組和非結核組。骨結核診斷標準：(1)病理學診斷，標本活檢的組織病理結果顯示為結核性肉芽腫和干酪樣壞死組織；(2)細菌學診斷，局部膿液抗酸染色涂片或MTB培養提示陽性；(3)臨床診斷標準，臨床表現、影像學等支持結核、排除其他疾病，且診斷性抗結核治療有效者。局部組織、膿液抗酸涂片和MTB培養陽性是目前確診骨結核的金標準。骨結核組111例，包括脊柱結核72例(64.87%)，關節及其他部位骨結核39例(35.13%)；非結核組101例。兩組性別、年齡資料見表1。

表1 骨結核和非結核組的基本資料

1.2方法

1.2.1提取單個核細胞(PBMC) 所有患者空腹抽取靜脈全血4 mL，加入肝素鋰抗凝管。加入同比例培養基混勻，將稀釋后的全血緩慢加入淋巴細胞分離液離心管內，形成液面層，梯度離心分離PBMC，用細胞培養基清洗2次，離心后棄上清液，用AIM-V培養基調整細胞濃度為2.5×105/mL懸液。

1.2.2T-SPOT.TB檢測 使用T-SPOT.TB檢測試劑盒(Oxford Immunotec公司，生產批號：TEC220430、TEB086167、TEC233280)檢測。每個標本設4個孔，分別將 A抗原(ESAT-6)、B抗原(CFP-10)、空白對照(AIM-V培養基)和陽性對照(植物血凝素)，加入到包被有INF-γ單抗的96孔板孔內，每孔各加入50 μL，然后加入分離后的細胞懸液100 μL，37 ℃、5%CO2培養箱放置16～20 h，棄細胞懸液后PBS洗滌3次，分別加入二抗和底物顯色，吹干后讀數。用ELISPOT斑點分析儀(AID公司)計數斑點形成細胞(SFCs)。每個斑點代表一個活化的特異性T淋巴細胞。減去空白孔后任一孔斑點≥6為陽性，如果空白孔斑點數≥6時，任一實驗孔大于空白對照2倍為陽性。本試驗設靜脈血界值24 SFCs/106PBMC為陽性。A抗原和B抗原任一個陽性即為陽性。

1.3統計學處理 統計學分析用GraghPad Prism 8軟件，計算診斷實驗評價指標的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值；繪制ROC曲線，確定診斷最佳臨界值。計數資料以例數表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1骨結核和非結核組T-SPOT.TB檢測結果比較 T-SPOT.TB檢測輔助診斷骨結核的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為91.89%、63.37%、73.38%、87.67%。T-SPOT.TB檢測在骨結核組和非結核組陽性數差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 骨結核和非結核組T-SPOT.TB檢測結果比較(n)

2.2T-SPOT.TB不同抗原檢測輔助診斷骨結核的效能分析 外周血ESAT-6抗原診斷骨結核的最佳臨界值是46 SFCs/106PBMC，曲線下面積(AUC)是0.881 9。外周血CFP-10抗原診斷骨結核的最佳臨界值是34 SFCs/106PBMC，AUC是0.878 0。ESAT-6+CFP-10抗原診斷骨結核的最佳臨界值是88 SFCs/106PBMC，AUC是0.911 0。見表3。

表3 T-SPOT.TB不同抗原檢測輔助診斷骨結核的效能分析

2.3T-SPOT.TB不同抗原檢測輔助診斷脊柱結核的效能分析 外周血ESAT-6抗原診斷脊柱結核的最佳臨界值是50 SFCs/106PBMC，AUC是0.895 1。CFP-10抗原診斷脊柱結核的最佳臨界值是34 SFCs/106PBMC，AUC是0.878 4。ESAT-6 + CFP-10抗原診斷脊柱結核的最佳臨界值是114 SFCs/106PBMC，AUC是0.912 3。見表4。

表4 T-SPOT.TB不同抗原檢測輔助診斷脊柱結核的效能分析

3 討 論

骨結核是肺外結核的重要組成部分，其疾病進展緩慢、無特異性臨床表現，容易導致患者的骨關節實質性破壞，給臨床診斷和治療帶來巨大的挑戰。骨結核通常以局部疼痛和壓痛為主要臨床表現，同時伴有炎性指標增高[4]，臨床常規應用的檢測項目包括細菌學檢測、免疫學檢測、病理學檢查和影像學檢查等。細菌學和病理學檢測雖然是結核病診斷的金標準，但存在一些缺陷，MTB培養時間長，病理學檢測屬于有創性檢查，而且二者檢測陽性率均較低。免疫學檢測方法主要包括結核菌素試驗和抗結核抗體檢測，其靈敏度和特異度較差[5]。MRI等影像學檢查在臨床中也有重要作用，但一些癥狀不典型或疾病早期的患者往往影像學表現不顯著，均給骨結核的診斷帶來了難題[6]。T-SPOT.TB是近年來出現的免疫檢測新方法[7]，研究證實，檢測外周血T-SPOT.TB是診斷活動性和隱匿性結核病的有效方法[8]。除檢測外周血T-SPOT.TB外，還可檢測胸腔積液、腹水、腦脊液T-SPOT.TB[9]，不同種類標本聯合檢測T-SPOT.TB可提高結核病的診斷率[10-11]。有研究顯示，T-SPOT.TB檢測在腸結核中也有較好的輔助診斷價值[12-13]。本研究評價T-SPOT.TB檢測對骨結核的輔助診斷價值。

本研究回顧性分析了疑似骨結核患者的全血標本212例，根據臨床診斷分為骨結核組111例和非結核組101例，均進行了T-SPOT.TB檢測。T-SPOT.TB檢測輔助診斷骨結核的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別是91.89%、63.37%、73.38%、87.67%，結果提示T-SPOT.TB檢測可作為診斷骨結核的有效輔助手段。YUAN等[14]報道對65 例疑似非典型性脊柱結核患者進行T-SPOT.TB檢測，其靈敏度和特異度分別為83%和81%。姚利等[15]納入8篇研究T-SPOT.TB檢測對脊柱結核診斷價值的文獻進行Meta分析，結果提示外周血T-SPOT.TB檢測診斷脊柱結核的靈敏度為88%，特異度為90%，陽性似然比為8.67，陰性似然比為0.13，AUC為0.95。本研究中T-SPOT.TB檢測診斷骨結核的特異度與以上報道一致，但靈敏度略低。

臨床上使用的試劑盒上推薦的外周血T-SPOT.TB診斷臨界值是24 SFCs/106PBMC，適用于肺內結核的診斷，但對于骨結核T-SPOT.TB的診斷臨界值報道不一。本研究根據入組患者外周血ESAT-6、CFP-10抗原單項檢測和ESAT-6+CFP-10 抗原聯合檢測，建立ROC曲線，確定診斷骨結核的最佳臨界值，骨結核外周血ESAT-6抗原的診斷最佳臨界值是46 SFCs/106PBMC，CFP-10抗原的診斷最佳臨界值是34 SFCs/106PBMC，均高于試劑盒上推薦的臨界值。脊柱結核通常占全身骨結核的發病首位，本研究病例中也顯示脊柱結核發病率較高，占骨結核組的64.87%，因此，將脊柱結核也做了單獨統計，其診斷最佳臨界值與骨結核組基本一致。ESAT-6+CFP-10抗原診斷骨結核的最佳臨界值是88 SFCs/106PBMC，AUC明顯優于ESAT-6或CFP-10單抗原檢測，具有較好的靈敏度和特異度。

綜上所述，T-SPOT.TB檢測可作為輔助診斷骨結核的有效方法，ESAT-6+CFP-10抗原聯合檢測的診斷效能優于單抗原檢測。