NSCLC癌組織中DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達情況與淋巴結轉移和預后的相關性

馮海玲，范長玲，潘中軍，何圣科，張 敏

海南省儋州市人民醫院：1.病理科；2.檢驗科,海南儋州 571700

非小細胞肺癌(NSCLC)是臨床較為常見的惡性腫瘤之一，流行病學調查顯示，NSCLC約占肺癌總數的80%[1]。NSCLC發病早期均無明顯的癥狀，大多數患者發病時已為晚期，喪失了手術治療的絕佳時機[2]。所以，在臨床治療中，通過對患者臨床標志物的分析進行臨床輔助診斷已經成為目前研究的熱點。雙腎上腺素樣激酶 1(DCLK1)是神經元細胞有絲分裂的重要微管相關激酶[3]，有研究顯示，DCLK1可通過對NSCLC患者的微小RNA(miRNA)-144水平的顯著性抑制，進一步促進腫瘤細胞的上皮間質化，對腫瘤的進展具有重要作用[4]。GLI家族鋅指蛋白3(GLI3)可通過對NSCLC癌細胞的增殖以及凋亡的調控，進而促進腫瘤細胞的轉移[5]。半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)是腫瘤細胞凋亡途徑中最為重要的執行因子，通過對上游信號的顯著性激活，引發局部級聯反應，進一步引起細胞凋亡[6]。本研究主要通過對NSCLC癌組織中DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達情況與其淋巴結轉移和預后的相關性分析，為NSCLC的臨床診斷以及預后評價提供科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年2月至2017年3月本院診斷的NSCLC患者60例作為研究對象，其中男36例，女24例;年齡59～77歲，平均(64.24±2.09)歲；平均體質量指數(BMI)為(24.66±2.11)kg/m2；病程4～11年，平均(6.44±2.39)年；TNM分期：ⅢA期11例、ⅢB期37例、Ⅳ期12例；病理類型：腺癌32例，鱗癌28例；腫瘤位置：中央型32例，周圍型28例；有淋巴結轉移33例，無淋巴結轉移27例。納入標準：(1)所有患者均符合NSCLC診斷標準[7]；(2)預計生存時間>6個月；(3)心電圖無異常；(4)腫瘤大小均可經CT進行測量；(5)患者卡氏評分≥70分，身體可耐受化療。排除標準：(1)診斷或合并小細胞肺癌者；(2)治療過程中出現嚴重中性粒細胞降低、神經毒性以及外周神經炎患者；(3)有嚴重精神障礙無法配合者；(4)有嚴重心臟、肝、腎功能障礙的患者；(5)對本研究藥物過敏或者不耐受患者。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法 所有患者均進行肺部活檢，取患者的癌組織以及癌旁組織，采用石蠟包埋后進行連續切片，切片的厚度設定為4 μm，采用pH6.0的檸檬酸修復液對石蠟切片進行脫蠟以及脫水，采用高壓加熱法對抗原進行修復。分別采用1∶100的DCLK1、Caspase-3和GLI3抗體進行滴加，在4 ℃下孵育過夜，采用多聚物酶標二抗進行滴加后，在37 ℃下繼續孵育45 min，采用二氨基聯苯胺(DAB)進行顯色，蘇木精進行復染。細胞質內出現棕黃色或棕褐色顆粒物即為DCLK1、Caspase-3和GLI3陽性。采用染色強度以及陽性細胞的二級計數法對DCLK1、Caspase-3和GLI3進行評分，無染色為0分，淡黃色為1分，黃褐色為2分，深褐色為3分。陽性細胞比例<10%為0分，10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～100%為3分。將染色強度以及染色比例的評分乘積作為以上蛋白表達程度的評價依據，6分以下為低表達，6分及6分以上為高表達[8]。比較癌組織以及癌旁組織DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達情況的差異；比較不同病理狀態、不同預后的患者癌組織DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達情況的差異。分別對癌組織的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達情況與腫瘤的淋巴結轉移、預后之間的相關性進行分析。所有患者均進行安羅替尼靶向治療3個月，且對所有患者展開為期3年的隨訪，以死亡作為終點事件，將其分為死亡組和生存組。

1.3統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Spearman相關進行相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1癌組織及癌旁組織的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達情況比較 癌組織的Caspase-3和GLI3蛋白高表達比例顯著高于癌旁組織，DCLK1蛋白的高表達比例顯著低于癌旁組織，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織以及癌旁組織中的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達情況比較[ n(%)]

2.2不同臨床特征患者癌組織中的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達情況比較 不同性別、年齡、TNM分期患者癌組織中DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達情況之間差異均無統計學意義(P>0.05)；腺癌患者癌組織中的Caspase-3和GLI3蛋白高表達比例顯著高于鱗癌患者，DCLK1蛋白高表達比例顯著低于鱗癌患者，差異均有統計學意義(P<0.05)；有淋巴結轉移的患者癌組織中的Caspase-3和GLI3蛋白高表達比例顯著高于無淋巴結轉移的患者，DCLK1蛋白高表達比例顯著低于無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床特征患者癌組織中的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達情況比較[ n(%)]

2.3不同預后患者癌組織中的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達情況比較 至隨訪結束，死亡組20例，生存組40例。死亡組癌患者癌組織中的Caspase-3和GLI3蛋白高表達比例顯著高于生存組，DCLK1蛋白高表達比例顯著低于生存組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同預后患者癌組織的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達情況比較[ n(%)]

2.4相關性分析 NSCLC的淋巴結轉移以及不良預后分別與癌組織中Caspase-3和GLI3蛋白表達情況呈正相關(P<0.05)，與DCLK1蛋白表達情況呈負相關(P<0.05)，見表4。

表4 相關性分析

3 討 論

NSCLC是臨床發病率較高的惡性腫瘤之一[9]，疾病的早期臨床癥狀不明顯，加之早期診斷能力有限，多數患者在確診時已處于晚期，喪失了手術治療的最佳時機。所以在疾病的早期，通過對NSCLC患者生化指標的分析來進行臨床輔助診斷對于疾病的診治具有重要意義[10]。

在早期的研究中，DCLK1主要參與神經元細胞的逆行運輸以及遷移，同時在一定程度上還參與了神經元細胞的凋亡。有研究報道，在細胞有絲分裂過程中，DCLK1可通過與微管細胞的顯著性結合作用[11]，共同形成細胞骨架，同時在細胞的細胞周期以及分化過程中發揮重要作用。目前已經證實，DCLK1在胃癌、胰腺癌、結腸癌以及肝癌中呈顯著高表達[12]。本研究對不同預后以及淋巴結轉移情況患者的DCLK1蛋白表達情況分析發現，隨著患者淋巴結轉移的發生以及不良預后的發展，患者的DCLK1水平顯著下降。周美玲等[13]的研究報道，DCLK1與NSCLC腫瘤細胞的淋巴結轉移顯著相關。隨著疾病的進展，由于腫瘤細胞對正常細胞的破壞能力增強，正常細胞的骨架被顯著破壞，因此患者的DCLK1水平顯著下降。

GLI3蛋白是通路轉錄因子蛋白中的重要分子，在Hh信號通路中具有重要作用。在Hh信號通路中，GLI3蛋白通過對NSCLC腫瘤細胞增殖、凋亡以及耐藥情況的介導，進而促進腫瘤進展。在動物實驗中已經證實，通過對實驗小鼠進行氯化鉀抑制糖原合成酶激酶的作用，進一步促進GLI3蛋白的加工合成能力，在一定程度上促進了直腸癌的進展[14]。陳盈盈等[15]通過對NSCLC患者GLI3蛋白水平的分析發現，隨著患者的疾病進展，患者的GLI3蛋白水平顯著升高，提示在淋巴結轉移過程中，GLI3蛋白還可通過血行播散等方式促進腫瘤的進展。

在NSCLC的病程中，由于腫瘤細胞對正常細胞的顯著性破壞作用，局部組織的炎性反應加重，而Caspase-3主要是在Nod樣受體家族pyrin結構域蛋白3(NLRP3)的C末端進行胱天蛋白募集以及在熱蛋白結構域的作用下形成，在此形成過程中，由于炎性反應被顯著激活，局部炎性反應水平呈級聯式增長，進一步造成正常細胞的凋亡。肖麗娜等[16]在對NSCLC患者Caspase-3表達水平與腫瘤細胞凋亡情況的分析中發現，患者的Caspase-3水平與腫瘤細胞的凋亡呈正相關。

綜上所述，NSCLC的淋巴結轉移以及不良預后分別與癌組織中Caspase-3和GLI3蛋白表達情況呈正相關，與DCLK1蛋白表達情況呈負相關，可為日后臨床診斷提供依據。但本研究也存在一定的局限性，如樣本量較小，所選取的患者均為中晚期患者等，有待后續進一步研究。