植物青枯菌噬菌體保存方法的研究

劉露　林志堅　周挺等

中圖分類號：S 476 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh 2020162

作物青枯病是一類典型的土傳細(xì)菌性維管束病害，易發(fā)生，難防治。20世紀(jì)初，TWwort和dHerelle發(fā)現(xiàn)并報道了噬菌體（bacteriophage，phage），其廣泛存在于自然界中。由于其具有寄生專一性、不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，被冠以細(xì)菌的天然“殺手”而備受關(guān)注，具有巨大的應(yīng)用潛力。噬菌體是嚴(yán)格的專性活體寄生物，無完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有株系間差異大等特點(diǎn)，導(dǎo)致在保存上必須采用不同的方法。Ackermann等報道，芽胞桿菌噬菌體AP50在-80℃下僅能存活6個月，而腸桿菌噬菌體PRD1保存12年效價僅降低3個數(shù)量級;王紹花2010年報道德氏乳桿菌噬菌體phiLdb在4℃下可保存6個月，于美玲2015年報道乳桿菌烈性噬菌體Lpla保存效果最好的溫度是-80℃。高苗發(fā)現(xiàn)，青枯菌噬菌體∈RS-1原液于4℃下保存6個月后尚存較高的活性。因此，要開發(fā)利用噬菌體，首要的問題就是噬菌體的長期保存。由于不同的噬菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)各異，對不同條件的響應(yīng)能力不同，以何種形式或方法保存，目前尚無明確定論。本研究以福建不同煙區(qū)分離的4株青枯菌噬菌體為對象，研究不同保存條件下噬菌體的活性變化，尋找適合噬菌體長期保存的方法。

1材料與方法

1.1供試菌株

青枯病菌Ral3tonia pseudosolanacearum Z5;青枯病菌短尾噬菌體Pl，P2，P3和P4均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定保存。

1.2青枯病菌培養(yǎng)

將保存于-75℃的青枯病菌Z5活化后挑取單菌落于裝有100 mL NB培養(yǎng)基（蛋白胨5g/L、牛肉浸膏3 g/L、葡萄糖2.5 g/L，pH 7.2）的三角燒瓶中，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)至濃度約1×10⁸cfu/mL，備用。

1.3噬菌體培養(yǎng)

按1%（ V/V）的接種量將噬菌體原液接種于1.2培養(yǎng)的青枯病菌懸浮液中，搖勻，靜置15 min，28℃，130r/min振蕩培養(yǎng)12～16h，獲得噬菌體培養(yǎng)液，12000r/min離心5 min后經(jīng)0.45μm濾膜抽真空過濾除菌，上清液為噬菌體原液，效價為2×10¹⁰PFU/mL，備用。

1.4噬菌體保存方法

設(shè)4個處理，處理1：噬菌體原液;處理2：噬菌體原液：青枯菌液=1：1（V/V，下同）;處理3：噬菌體原液：青枯菌液：40%甘油=1：1：2（1mL噬菌體原液和1mL青枯菌液以及2mL 40%甘油的混合液）;處理4：噬菌體原液：青枯菌液：80%甘油=1：1：2（1mL噬菌體原液和1mL青枯菌液以及2mL80%甘油的混合液）。分別置于-75、-25、4℃和室溫保存，90、180、270 d和365 d分別取樣，測定噬菌體的效價。

1.5噬菌體的效價測定

噬菌體效價（plaque-forming unit，PFU）：是指每毫升樣品中所含有的具有侵染性的噬菌體粒子數(shù)，采用雙層平板法測定，具體測定方法參照高苗的方法。

噬菌體效價（PFU/mL）=平均噬菌斑數(shù)×2×稀釋倍數(shù)。

2結(jié)果與分析

4種不同處理的噬菌體分別在-75、-25、4℃、室溫下保存的結(jié)果見表1～表4。結(jié)果表明，-75℃和-25℃下保存（表1、表2），4種處理的保存效果都較好，365d后效價下降0～3個數(shù)量級，其中噬菌體P4株系的保存效果最好，其次為噬菌體P1和P2株系，噬菌體P3株系較差，如保存365 d后噬菌體P4株系效價只下降0～1個數(shù)量級，噬菌體P3株系效價卻下降1～3個數(shù)量級;4℃下保存（表3），噬菌體原液處理和噬菌體原液：青枯菌液=1：1處理的保存效果最好，365 d后效價下降1～5個數(shù)量級，其中噬菌體P4株系效價只下降1個數(shù)量級，噬菌體原液：青枯菌液：40%甘油=1：1：2處理的保存效果次之，365 d后效價下降5～7個數(shù)量級，噬菌體原液：青枯菌液：80%甘油=1：1：2處理的保存效果最差，90 d后效價下降6～7個數(shù)量級;室溫保存的效果總體較差（表4），但其中噬菌體原液：青枯菌液=1：1處理的保存效果相對較好，180 d后效價下降1～2個數(shù)量級，270 d后效價下降6～7個數(shù)量級;其次為噬菌體原液處理，噬菌體Pl和P2株系保存90 d后全部失活，而噬菌體P3和P4株系保存180 d后，其效價下降6個數(shù)量級;噬菌體原液：青枯菌液：40%甘油或80%甘油=1：1：2處理的保存90 d后，噬菌體P1、P3和P4株系全部失活，但噬菌體P2株系采用噬菌體原液：青枯菌液：40%甘油=1：1：2處理，保存365 d仍有較高的活性，效價僅僅下降3個數(shù)量級。

3討論

噬菌體的保存方法已有報道，主要集中在對動物病原細(xì)菌噬菌體的保存，常見的有噬菌體原液或噬菌體原液加入甘油、DMSO等保護(hù)劑，于室溫、4℃、凍干、-75'C或液氮保存，但噬菌體不同，效果也不同。如李隴平等報道金黃色葡萄球菌烈性噬菌體加入7% DMSO，-80℃冷藏3個月，效價與初始效價保持同一個指數(shù)級;黎爾納等報道3株木糖氧化無色桿菌噬菌體原液加入甘油或DMSO后，于-80℃、-20℃和4℃保存16個月后，其中2株的效價能穩(wěn)定在初始狀態(tài)，1株的效價降低1個數(shù)量級。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果相似，供試的4株噬菌體同法同溫保存，但效果不同，如采用噬菌體原液：青枯菌液：80%甘油=1：1：2方法-75℃保存365 d，噬菌體P3株系的效價下降2個數(shù)量級，而噬菌體P1、P2和P4株系的效價穩(wěn)定在初始狀態(tài);采用噬菌體原液室溫保存，90 d后噬菌體Pl和P2株系全部失活，270 d后噬菌體P3株系全部失活，而噬菌體P4株系仍有活性。

Golec等報道，-80℃下有尾噬菌體儲存于宿主體內(nèi)，不會影響噬菌體和宿主的生存能力;高苗報道噬菌體原液+20%甘油室溫和4℃保存6個月后均檢測不到噬菌斑。本研究結(jié)果顯示，室溫和4℃下添加宿主可提升保存效果，添加甘油反而不利;低溫下（-75℃和-25℃）添加宿主對噬菌體的保存效果影響不大，但添加甘油可提升保存效果。室溫下，噬菌體原液：青枯菌液=1：1保存180 d，效價下降1～2個數(shù)量級，而噬菌體原液保存的效價下降了6個數(shù)量級或全部失活;另外，添加甘油處理的噬菌體90 d后全部失活（噬菌體P2株系除外）;-75℃和-25℃下，添加甘油處理的保存365d，噬菌體效價降幅最大的僅2個數(shù)量級。由于噬菌體是一種寄生于活體細(xì)胞內(nèi)的非細(xì)胞生物，一旦離開寄主就不能獨(dú)立新陳代謝，但低溫可降低其新陳代謝，保持活性，因此低溫可提高噬菌體的保存效果;室溫下，由于噬菌體的代謝活動正常，需要充足的宿主，因此添加宿主有利于噬菌體保持活性，若添加甘油，宿主受甘油保護(hù)，噬菌體的侵染幾率下降或完全不能侵入，導(dǎo)致效價下降。

綜上所述，噬菌體原液：青枯菌液=1：1處理在4種溫度下保存都能保持較高的活性，尤其是室溫保存180 d后，噬菌體效價僅下降1～2個數(shù)量級，保存270 d后噬菌體仍有較高的活性。該方法不需要添加保護(hù)劑，不受試驗(yàn)條件限制，可為今后噬菌體制劑的生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考依據(jù)，是青枯菌噬菌體最簡單易行的保存方法。另外，無論何種處理，-75℃和-25℃的保存效果都表現(xiàn)最好，可長期保存噬菌體。