轉Cp4 epsps基因大豆快速DAS-ELISA檢測方法的建立

候吉超　李忠鵬　梁雨欣等

中圖分類號：S 565.1.Q 943.2 文獻標識碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2020133

草甘膦（glyphosate）又稱鎮草寧，1971年由美國貝爾德等發現，并由孟山都公司開發生產，目前已成為全球銷量最大的除草劑品種。來自土壤農桿菌CP4的epsps基因所編碼的CP4-EPSPS蛋白由于對草甘膦具有高抗性而被廣泛應用于轉基因作物。目前，我國已獲得多個轉Cp4 epsps基因農作物，包括大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜和苜蓿等。中國是大豆原產國，同時也是大豆需求大國，每年我國從美國、巴西、阿根廷等國進口大量轉基因大豆，年進口總量由1996年的57萬t上升到2019年的8851萬t，進口量不斷攀升。隨著轉基因大豆大量進口及其相關產業的不斷壯大，轉基因大豆的安全問題逐漸引起人們的關注。因此，建立轉基因大豆新型快速檢測技術顯得尤為重要。

目前，轉基因作物的檢測主要分為核酸檢測和蛋白質檢測兩大類。核酸檢測以PCR檢測技術為主，此外還相繼建立了巢式PCR、熒光定量PCR和Southern-blot等檢測技術。PCR檢測技術具有特異性強、靈敏度高等特點。蛋白檢測主要為血清學檢測技術，包括ELISA、雙抗夾心ELISA（DAS-ELISA）和斑點ELISA（Dot-ELISA）等檢測技術。血清學檢測技術具有重復性好、操作簡便等特點，對檢測環境、儀器要求較低，適合在基層推廣應用。在血清學檢測的基礎上，研究者進一步研制出了膠體金試紙條檢測技術，但是對轉基因加工制品靈敏度較低。

本研究以CP4-EPSPS單克隆抗體和多克隆抗體為基礎，成功建立檢測轉Cp4 epsps基因大豆快速DAS-ELISA方法，將檢測時間由普通DAS-ELISA的150 min縮短至75 mln。通過對檢測條件的優化，提高該檢測方法的準確性、簡便性，實現對轉Cp4 epsps基因大豆的快速檢測。

1材料與方法

1.1材料與試劑

CP4-EPSPS標準蛋白、CP4-EPSPS特異性單克隆抗體1D12、羊多克隆抗體8092由本實驗室制備;非轉基因‘Williams和轉Cp4 epsps基因大豆‘W-82系列由吉林省農業科學院農業生物技術研究所提供;辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗CP4EPSPS多克隆抗體8092由南京鐘鼎生物技術有限公司提供;雙組分TMB顯色液購于北京索萊寶科技有限公司;脫脂奶粉購于生工生物工程（上海）股份有限公司;HRP標記兔抗小鼠IgG購于Sigma公司。

1.2儀器與設備

BioTek洗板機、BioTek酶標儀購于美國伯騰儀器有限公司;高速冷凍臺式離心機購于日本日立公司;恒溫培養振蕩器購于上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1快速DAS-ELISA方法的建立

以CP4-EPSPS單克隆抗體1D12為捕獲抗體包被96孔酶標板100μL/孔，40C靜置過夜，加入5%脫脂奶粉250μL/孔，37℃封閉1h;樣品用PBS緩沖液適當稀釋后，充分研磨、離心、取上清液，將上清液與檢測抗體HRP標記的多克隆抗體8092先后加入96孔酶標板，各50μL/孔，37℃靜置孵育1h，以上每一步結束后96孔酶標板用PBST洗3遍，拍干;加TMB顯色液90μL/孔，避光顯色5～15 min，加入2 mol/L H₂SO₂溶液45μL/孔終止反應。以檢測樣品OD₁₅₀（P值）/陰性對照OD₁₅₀（N值）≥2.1判定為陽性檢測結果。

試驗重復3次，同時設置陽性（轉Cp4 ep3-ps基因大豆葉片）、陰性（非轉基因大豆葉片）、空白（去離子水）3個對照。

1.3.2快速DAS-ELISA方法的優化

以非轉基因和轉Cp4 ep3-ps基因大豆葉片作為陰性對照和陽性對照，運用建立的快速DAS-ELISA方法進行檢測。采用矩陣滴定法優化捕獲抗體和檢測抗體的工作濃度，以P/N最大值確定抗體工作濃度。運用DAS-ELISA方法分別對捕獲抗體孵育時間、待測樣品與檢測抗體共同孵育時間進行優化，以P/N最大值確定捕獲抗體孵育時間，同時分析P/N值，選擇合適的樣品與檢測抗體共同孵育時。

1.3.3快速DAS-ELISA方法檢測范圍的確定

用PBS將CP4-EPSPS蛋白標準品濃度從160μg/mL等比稀釋至0.078 125μg/mL，運用優化后的快速DAS-ELISA方法進行檢測，每個濃度3個技術重復，以蛋白濃度為橫坐標，P/N值為縱坐標，繪制靈敏度曲線，得出快速DAS-ELISA方法的檢測范圍。

1.3.4檢測材料的優化

根據1.3.3小節的試驗結果對大豆葉片和籽粒進行稀釋度優化，采集非轉基因和轉Cp4 epsps基因大豆葉片和籽粒，葉片用PBS緩沖液（1g樣品：10 mL PBS）充分研磨后，用PBS緩沖液等比稀釋至1：20 000倍;籽粒處理方法同葉片，最終等比稀釋至1：640倍;12 000r/min離心5min，取上清液，運用建立的快速DAS-ELISA方法對其進行檢測，根據P/N值，得出葉片和籽粒檢測時的稀釋區間。

1.3.5重復性試驗

運用建立的快速DAS-ELISA方法檢測轉Cp4 epsps大豆葉片和種子各4份，每份材料3個技術重復，測定OD₁₅₀，分別計算板內、板間變異系數。

1.3.6田間樣品檢測

試驗田中隨機采集100份大豆植株葉片，用PBS緩沖液從1：10至1：320倍之間隨機稀釋，充分研磨，12 000r/min離心5 min，取上清液，運用上述建立的快速DAS-ELISA方法對其檢測，同時利用Western blot方法檢測，以單抗1D12為一抗（1：5000稀釋），HRP標記的兔抗小鼠IgG為二抗（1：10000稀釋），對比二者檢測結果，并運用建立的檢測方法對5粒非轉基因和15粒轉Cp4 epsps基因大豆籽粒進行檢測，驗證檢測方法效果。

1.4數據分析

試驗均進行3次重復，數據處理采用SPSS 20.0進行顯著性分析和Graphpad Prism 8.0軟件進行作圖。

2結果與分析

2.1 CP4-EPSPS蛋白快速DAS-ELISA檢測方法的建立

采用矩陣滴定法篩選捕獲抗體和檢測抗體的最佳工作濃度（表1），當捕獲抗體工作濃度為10 μg/mL，檢測抗體工作濃度為1. 25μg/mL時，P/N值最大，表明在此濃度下檢測效果最好，確定其為抗體最佳工作濃度。分別對捕獲抗體、待測樣品與檢測抗體共同孵育時間進行優化，結果如圖1所示，捕獲抗體最佳包被條件為37℃2h后4℃過夜;據圖2所示，當待測樣品與檢測抗體37℃共同孵育75min時，P/N值最大，但37℃孵育60 min和75 min時P/N值無顯著差異，本研究建立的檢測方法以快速定性為主，綜合考慮，確定樣品與檢測抗體最佳共同孵育條件為37℃孵育60 min。

1）P/N為檢測樣品OD₁₅₀/陰性對照OD₁₅₀。 P/N is the ratio of OD₁₅₀between sample and blank control.

2.2快速DAS-ELISA檢測范圍的確定

運用建立的快速DAS-ELISA方法對不同濃度CP4-EPSPS蛋白標準品溶液進行檢測，建立CP4EPSPS蛋白靈敏度曲線，如圖3所示，當CP4-EPSPS蛋白濃度在0.3125～80μg/mL時，檢測結果為陽性，即該方法的檢測范圍。

2.3檢測材料的優化

對轉Cp4 epsps基因大豆葉片、籽粒蛋白粗提液濃度進行優化，如表2所示，當轉Cp4 epsps基因大豆葉片樣品稀釋10～5000倍時，檢測結果呈陽性，且稀釋80倍時P/N值最大，因此，確定葉片樣品稀釋區間為10～80倍;如表3所示，籽粒樣品稀釋10～320倍時，檢測結果呈陽性，為了便于操作，確定籽粒樣品稀釋區間為10～80倍。在該稀釋范圍內，檢測效果較好，有利于快速定性檢測轉Cp4 epsps基因大豆。

2.4重復性試驗

運用建立的快速DAS-ELISA方法對8份樣品進行檢測，結果如表4所示，8份樣品板內變異系數為1. 64%～5. 42%，板間變異系數為3.05%～9.13%，變異系數均小于25%，表明建立的檢測方法穩定性較好，符合ELISA定性試劑盒參考標準。

2.5田間樣品檢測緒果比較

Western blot檢測結果如圖4所示，100份檢測樣品中共計有53份樣品出現特異性免疫印跡，快速DAS-ELISA方法檢測結果顯示（表5），共計檢測出53份陽性樣品，對比兩種方法檢測結果，兩種檢測方法符合率為100%，對20份已知的大豆籽粒進行檢測（W代表非轉基因大豆，C代表轉Cp4 epsps基因大豆），非轉基因大豆P/N值<2.1，轉基因大豆P/N值≥2.1，與標準結果比較檢測符合率為100%（表6）。

3討論

本研究以非轉基因和轉Cp4 epsps基因大豆葉片和籽粒作為試驗材料對快速DAS-ELISA工作條件進行優化，與使用重組蛋白作為試驗材料相比，結果更真實可靠。蛋白免疫印跡雜交（West-ern-blot）是鑒定轉基因生物的標準方法，本研究以Western-blot檢測結果作為標準衡量快速DAS-ELISA的準確性。對100份大豆樣品的檢測結果分析發現，本研究建立的快速DAS-ELISA準確率為100%。

為了縮短檢測時間，本研究優化了檢測方法。首先，檢測抗體經HRP標記，省去了酶標二抗的反應步驟：此外，將抗原孵育和檢測抗體孵育這兩步反應合并為一步進行，進一步減少了檢測步驟。檢測過程僅需要兩步，將檢測時間縮短至75 min，目前，國外進口試劑盒檢測時間在2. 5～3.5 h之間。本檢測方法中，樣品孵育超過30 min時，檢測結果即呈陽性，因此在實際檢測中，孵育30 min可以作為樣品與抗體反應最短時間。

在測定DAS-ELISA的檢測范圍時發現，隨著CP4-EPSPS蛋白濃度等比例逐漸降低，P/N值呈現出先上升后下降的趨勢，出現這種情況，是因為當蛋白過飽和時，部分蛋白沒有結合檢測抗體而與捕獲抗體直接結合，最終影響P/N值。

綜上所述，本研究建立的快速DAS-ELISA方法適用于轉Cp4 epsps基因大豆植株和種子的快速檢測，為轉基因后代材料的精準鑒定和轉基因大豆產品的監管提供技術手段，該檢測方法是否適用于玉米、水稻等作物還有待于進一步研究。