基于三維熒光的產麻痹性貝毒藻濃度監測研究

王思遠，張保軍，王 昊，茍偲鈺，李 煜，李新玉，談愛玲，江天久，畢衛紅*

1.燕山大學信息科學與工程學院, 燕山大學海洋科學與工程研究院，河北省特種光纖與光纖傳感重點實驗室，河北 秦皇島 066004 2.暨南大學，暨南大學赤潮與海洋生物學研究中心，廣東 廣州 510632

引 言

赤潮(red tide)是指水中的微生物由于水體環境及氣候等原因大量繁殖導致水體變色的現象[1]。近年來，我國沿海地區發生赤潮次數及面積持續增加，經濟損失嚴重[2]。其中，有毒赤潮產生的毒素可以通過食物鏈的傳遞導致人體中毒甚至死亡，在我國東海海域和長江口，多次發生大規模有毒藻赤潮，近岸海產貝類的食用安全風險增加[3-4]。有毒赤潮產生的毒素中，麻痹性貝毒(paralytic shellfish poisoning，PSP)由于其分布廣，毒性強而成為危害最大的生物毒素之一[5]。自1937年，首次發現鏈狀裸甲藻可產生PSP后，隨后又發現多種藻類可產生PSP，如亞歷山大藻屬中的塔瑪亞歷山大藻(A.tamarense)、鏈狀亞歷山大藻(A.catenella)、微小亞歷山大藻(A.minutum)是產PSP的主要藻類[6-7]。PSP是一種神經毒素，通過與動物神經細胞膜上的鈉離子通道位點結合，抑制鈉離子的內流，阻斷神經細胞之間膜電位的傳遞[8]。根據PSP攝入量不同，人類誤食染毒的貝類后，身體各部位會產生不同程度的刺痛甚至麻痹，中毒嚴重者會在短時間內死亡。因此，產麻痹性貝毒藻濃度是檢測PSP攝入量大小的重要指標，也是后期對產麻痹性貝毒藻預警的關鍵參考指標。

目前已建立的PSP檢測方法[9-11]有很多種，應用較廣泛的主要有生物檢測方法、免疫法、化學分析法。但由于測量時間過長、速度慢、產生二次化學污染、檢測頻率低等缺陷，不能實現現場、快速分析的實時連續測量。隨著近年來熒光檢測技術的進步，三維熒光光譜技術在藻類定量分析方面得到快速發展，且三維熒光光譜技術日益成熟，目前已開發出多種應用于石油、多氯聯苯、生物激素和微藻識別等方面的專業設備[12-14]。

本文主要基于三維熒光光譜技術結合化學計量學方法對產麻痹性貝毒藻進行濃度值的測量。通過測量活體產麻痹性貝毒藻的三維熒光光譜，對熒光光譜矩陣數據進行圖像分析，并將不同激發波長數據進行組合獲取產麻痹性貝毒藻類特征，將特征數據分別作為粒子群優化的最小二乘支持向量機算法[15]和偏最小二乘回歸的輸入，建立產麻痹性貝毒藻定量分析模型。

1 實驗部分

1.1 樣品

實驗所需的活體藻類樣本均由暨南大學赤潮與海洋生物學研究中心藻種室于2019年11月份提供；選取三種產麻痹性貝毒藻類，包括微小亞歷山大藻、鏈狀裸甲藻、太平洋亞歷山大藻，共36個樣本；活體藻樣本均在海水(將自然海水使用0.45 μm微孔濾膜過濾于錐形瓶中，121 ℃、15 psi下滅菌25 min，冷卻到室溫)中培養，其培養液(f/2改良配方配制)、溫度(25 ℃)、光照強度(60 μmol·m-2·s-1)和光暗循環(L∶D=12 h∶12 h)均按理想條件設定；每天固定時間取樣于顯微鏡下用0.1 mL浮游植物計數框進行藻細胞計數，繪制生長曲線，確定藻類的生長期；待產麻痹性貝毒藻處于對數期濃度最高時取出，用過濾后的海水稀釋10倍、100倍、1 000倍，搖勻，獲得不同濃度梯度下的產麻痹性貝毒藻的樣本。

1.2 儀器與參數

采用日本日立公司生產的F-4600熒光光譜儀采集光譜。光程為10 mm×10 mm的無熒光石英比色皿中，激發波長λex范圍設置為400～600 nm，步長為10 nm，發射波長λem范圍設置為650～750 nm，步長為10 nm，狹縫寬度5 nm，掃描速率為30 000 nm·min-1，光電倍增管電壓為700 V，激發光源為150 W的氙燈；為減小熒光強度隨儀器和光源使用時間變化引起的差異，保證測量的準確性，每次采集之前光譜儀先預熱20 min，測量3次后取平均值作為最終測量結果。以上數據采集均與活體藻類樣本取出為同一時間。

2 結果與討論

2.1 產麻痹性貝毒藻的原始三維熒光光譜

實驗測得三種產麻痹性貝毒藻不同濃度下共36個樣本的三維熒光光譜數據。其中微小亞歷山大藻的濃度分別為103，104和105cells·mL-1；鏈狀裸甲藻濃度分別103，104，105和106cells·mL-1；太平洋亞歷山大藻濃度分別為103，104，105和106cells·mL-1，利用origin2017軟件繪出藻類的三維熒光光譜圖。圖1(a)—(d)為不同濃度下鏈狀裸甲藻的等高線圖；圖2(a)—(d)為不同濃度下太平洋亞歷山大藻的等高線圖；3(a)—(c)為不同濃度下微小亞歷山大藻的等高線圖。

圖1 不同濃度下鏈狀裸甲藻等高線光譜圖

圖2 不同濃度下太平洋亞歷山大藻等高線光譜圖

圖3 不同濃度下微小亞歷山大藻等高線光譜圖

從圖1中可以看出，產麻痹性赤潮藻的熒光峰位置分布在激發波長為410～560 nm范圍內，不同濃度的產麻痹性貝毒藻因為藻種的不同，相同濃度下的熒光強度值也會存在差異。因此，需要探尋最優發射波長取值范圍以及借助化學計量學方法建立產麻痹性貝毒藻的定量分析模型。

2.2 產麻痹性貝毒藻三維熒光光譜特征區間選擇

為了確定產麻痹性貝毒藻定量分析模型的最佳發射波長范圍，本文利用產麻痹性貝毒藻發射波長范圍為650～700和650～750 nm的三維熒光光譜數據進行產麻痹性貝毒藻濃度建模，選取最優的光譜區間。

獲取36個產麻痹性貝毒藻樣本的單一激發波長下，發射波長范圍分別為650～700和650～750 nm的光譜數據作為PSO-LSSVM的輸入數據；隨機選取24個樣本作為訓練集，其余12個樣本作為預測集；為了減少濃度值的量級差給模型帶來的影響，將產麻痹性貝毒藻濃度值103，104，105和106cells·mL-1統一取對數得到濃度值對應的輸出值分別為3，4，5和6；基于PSO-LSSVM算法構建產麻痹性貝毒藻特征數據與新濃度值數據之間的相互關系，得到的預測濃度值再取10的冪次方，恢復原始等量級濃度值，進行模型評價。

從建立的產麻痹性貝毒藻定量分析模型中得到訓練集和預測集的相關系數(correlation coefficient，R)和均方根誤差(root mean square error，RMSE)如表1所示。其中RMSEC, RMSEP,Rc和Rp分別是訓練集均方根誤差、預測集均方根誤差、訓練集相關系數和預測集相關系數。

表1 單一激發波長下產麻痹性貝毒藻的PSO-LSSVM定量模型結果

從表1中可以看出，在單個激發波長下，對比發射波長范圍在650～700 nm的產麻痹性貝毒藻定量模型，發射波長范圍在650～750 nm的產麻痹性貝毒藻定量模型的相關系數更趨近于1，均方根誤差也較小。因此，以下選擇發射波長范圍在650～750 nm的產麻痹性貝毒藻分別建立PSO-LSSVM和PLSR的定量分析模型。

2.3 建立產麻痹性貝毒藻定量分析模型

針對36個產麻痹性貝毒藻樣本，選取激發波長是410～560 nm，發射波長在650～750 nm范圍內的三維熒光光譜數據作為PLSR算法的輸入，隨機取得24個樣本作為訓練集，其余12個樣本作為預測集，建立單一激發波長下的產麻痹性貝毒藻的定量分析模型，得到基于PLSR算法的部分預測集的均方根誤差和相關系數如表2所示。

表2 單一激發波長下PLSR算法的定量模型結果

從表1和表2中可以看出，對比PLSR算法，單一激發波長下利用PSO-LSSVM對產麻痹性貝毒藻建立的定量分析模型誤差較小，相關系數也更高。因此，以下采用PSO-LSSVM算法對產麻痹性貝毒藻進行定量分析。

針對36個產麻痹性貝毒藻樣本，根據窮舉法從410～560 nm中選取兩個激發波長，發射波長范圍在650～750 nm的產麻痹性貝毒藻數據進行串行組合，建立基于PSO-LSSVM算法的定量分析模型，得到的RMSEC、RMSEP、Rc和Rp部分結果如表3所示。

表3 兩個激發波長下PSO-LSSVM算法的定量模型結果

從表3中可以看出，當激發波長選擇460和530 nm，發射波長選擇650～750 nm作為PSO-LSSVM的輸入數據，建立的產麻痹性貝毒藻的定量分析模型效果最好。產麻痹性貝毒藻類訓練集和預測集中預測值和真值的關系如圖4所示，其中橫坐標為樣本個數，縱坐標為真實濃度值取對數所對應的輸出數值。

圖4 訓練集和預測集中預測值和真值的關系

從圖4可知，訓練集中預測值和真值幾乎重合，模型訓練效果較優；預測集中預測值和真值也有較好的相關性。將圖4中輸出濃度值取10的冪，恢復成產麻痹性貝毒藻的原始濃度值，并將預測值與真實值做線性擬合，擬合結果如圖5所示。從圖5中可以看出，雖然預測集中預測值和真值的相關系數Rp為0.9492，但也需要進一步優化模型。

圖5 預測集中預測值和真值的線性擬合結果

3 結 論

采集實驗室培養的不同濃度下的微小亞歷山大藻、鏈狀裸甲藻和太平洋亞歷山大藻，共36個產麻痹性貝毒藻的三維熒光光譜數據；建立激發波長為410～560 nm、發射波長范圍為650～750 nm的單一激發波長和兩個激發波長組合的表示方法；基于串行組合后的產麻痹性貝毒藻三維熒光光譜數據，隨機選取24個樣本作為訓練集，其余12個樣本作為預測集，建立PSO-LSSVM和PLSR的產麻痹性貝毒藻定量分析模型。結果表明，當激發波長選擇460和530 nm，發射波長選擇650～750 nm作為PSO-LSSVM的輸入數據時，建立的產麻痹性貝毒藻的定量分析模型中訓練集的決定系數為0.999 9，建模均方根誤差RMSEC為0.017 1；預測集的決定系數為0.949 2，預測均方根誤差RMSEP為0.291 0；建立的定量數學模型效果較好，可以通過得到的三維熒光數據較準確地檢測活體產麻痹性貝毒藻濃度數值，為產麻痹性貝毒藻的監測提供了一種新方法。