不同產地丹參及根際土壤無機元素分析與評價

劉沁榮，杜紫微，李佳珍，王一碩, 3*，顧 選，崔秀梅

1.河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450046 2.國藥集團北京華邈藥業(yè)有限公司，北京 102600 3.河南省中藥生產一體化工程技術研究中心，河南 鄭州 450046

引 言

丹參始載于《神農本草經(jīng)》，為臨床常用大宗中藥材，具有活血祛瘀、清心除煩、養(yǎng)血安神的功效[1]。化學成分種類豐富，包括丹參酮類、丹酚酸類、多糖類和無機元素等[2-4]，藥理研究表明丹參具有心肌保護、抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用[5]。其臨床應用廣泛，現(xiàn)以丹參為主的復方制劑約幾十種，涉及傳統(tǒng)丹膏丸散，注射液、滴丸、膠囊、片劑等。丹參因具有較高藥用價值市場需求量頗高，但隨著野生資源的減少現(xiàn)以人工栽培為主，其道地產區(qū)有山東、河南、四川、陜西等[6]。

國家藥典規(guī)定丹參入藥部位為根及根莖，根部作為植物和土壤進行物質能量交換的結點，對土壤養(yǎng)分需求較高。目前關于不同產地丹參的研究有相關報道，邵遠洋等通過測定不同產地鮮丹參活性成分含量，結果得出丹參質量存在產地特異性[7]；趙琦等以不同產地和品系丹參為研究對象，以產量和含量為考察指標，表明生長環(huán)境、土壤對丹參質量影響較大[8]；有學者對丹參化學成分和土壤進行比較，發(fā)現(xiàn)土壤元素影響著丹參酮成分的合成積累且與藥材活性成分存在相關性[9]。

原子吸收分光光度法作為一項重要的元素測定方法，在中草藥及成藥分析中起到了重要的作用。無機元素是自然界植物生長過程中所必需物質，是中藥的基本成分和藥材質量控制中不可或缺的特征參數(shù)[10]，已有對不同產地中藥材的礦物元素進行研究報道[11]，但尚未見對丹參藥材元素和土壤元素間相關性進行探討。以根際土壤和藥材為切入點，采用原子吸收分光光度法對不同產地丹參藥材及根際土壤中無機元素進行分析，總結丹參藥材與根際土壤兩者間關系，以期深入了解因土壤產區(qū)所產生的質量差異。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Z-2300原子吸收光譜儀(日立高新技術公司)；WX-4000微波消解儀(上海屹堯科技有限公司)；DKQ趕酸電熱板(上海屹堯科技有限公司)；單元素Na，Mg，K，Ca，Mn，F(xiàn)e，Cu和Zn對照溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心，質量濃度均為1 000 mg·L-1)，批號分別為(GSB0417202004，GSB0417711079，GSB0417382004，GSB0417304112，GSB0417011111，GSB0417710079，GSB0417210073，GSB0417805026)。

1.2 樣品采集與處理

丹參藥材從全國各產區(qū)采集，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學生藥學董誠明教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。為避免生長區(qū)域肥力均勻性差異，進行多點采樣；采用“抖根法”收集根際土壤，經(jīng)四分法進行風干處理收集備用，藥材、土壤信息見表1。

表1 藥材及土壤樣品信息

1.3 儀器參數(shù)

檢測原子吸收光譜的最佳儀器工作參數(shù)：空氣流量為15 L·min-1，空氣壓力為0.16 MPa，其他參數(shù)見表2。

表2 原子吸收光譜儀工作參數(shù)

1.4 樣品制備

供試品溶液制備[12]：取各產地丹參樣品粉碎過3號篩精密稱取丹參樣品粉末約0.5 g，加10 mL硝酸置聚四氟乙烯消解罐，放置6 h后至微波消解儀；精密稱取根際土壤樣品約0.5 g，加6 mL硝酸、3 mL鹽酸、2 mL氫氟酸置聚四氟乙烯消解罐，放至微波消解儀進行消解，消解程序見表3。將消解完畢的樣品置80 ℃電熱板趕酸冷卻30 min，加5%硝酸溶液至25 mL容量瓶。精密量取5%稀硝酸溶液10 mL稀釋至50 mL容量瓶，密封待測。空白溶液制備同上。

表3 微波消解儀工作參數(shù)

標準溶液制備：取Na，Mg，K，Ca，Mn，F(xiàn)e，Cu和Zn八種元素標準溶液，精密吸取0，0.05，0.10，0.15，0.20和0.25 mL于25 mL容量瓶中5%稀硝酸稀釋，5%稀硝酸為空白。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 22.0和SIMCA14.1軟件對數(shù)據(jù)進行整理分析。

2 結果與討論

2.1 線性關系及檢出限

將Na，Mg，K，Ca，Mn，F(xiàn)e，Cu和Zn八種元素標準溶液用5%稀硝酸逐級稀釋，5%稀硝酸為空白，測定各元素不同濃度標準溶液的吸光度值，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，求回歸方程及相關系數(shù)。單元素同濃度溶液連續(xù)進樣11次進行檢出限實驗，線性方程及檢出限結果見表4。

表4 線性回歸方程、檢出限

2.2 精密度試驗

取Na，Mg，K，Ca，Mn，F(xiàn)e，Cu和Zn八種元素各中間濃度標準溶液按照儀器工作參數(shù)重復測定6次，計算吸光度值相對標準偏差(RSD)值分別為0.25%，0.29%，0.12%，0.28%，0.12%，0.17%，0.86%和0.38%，均小于1.0%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復性試驗

按1.4節(jié)處理丹參樣品6份，按照1.3節(jié)儀器工作參數(shù)測定Na，Mg，K，Ca，Mn，F(xiàn)e，Cu和Zn八種元素，結果所得8種元素吸光度的RSD值分別為0.09%，0.72%，0.15%，0.34%，1.07%，0.25%，0.98%和0.35%，均小于1.10%，表明該法重復性良好。

2.4 加標回收率

稱取已知濃度的丹參樣品粉末，精密加入Na，Mg，K，Ca，Mn，F(xiàn)e，Cu和Zn八種元素標準溶液至一定濃度進行實驗，回收率為100.58%，97.88%，97.04%，101.16%，97.54%，97.03%，99.35%和96.91%，RSD值為1.08%，0.19%，1.67%，1.58%，2.10%，1.23%，0.79%和0.43%，均小于3.0%。

2.5 丹參8種元素含量測定

按照1.4節(jié)處理不同產地丹參樣品，在1.3節(jié)連續(xù)進樣3次計算平均值，結果見表5。

表5 不同產地丹參無機元素含量(mg·g-1)

2.6 根際土壤8種元素含量測定

按照1.4節(jié)處理不同產地根際土壤樣品，按1.3節(jié)最佳儀器工作參數(shù)連續(xù)進樣3次計算平均值，結果見表6。

表6 不同產地根際土壤無機元素含量(mg·g-1)

2.7 數(shù)據(jù)分析

2.7.1 聚類分析

以不同產地丹參8種無機元素含量結果為原始數(shù)據(jù)，采用組間連接法，以Euclidean距離為分類依據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析。結果顯示當Euclidean距離為25時，河南、陜西、山東、山西丹參被分為一類，四川單獨一類；當Euclidean距離為8時，河南和陜西丹參被分為一類，山東、山西丹參分為一類、四川單獨成類；當Euclidean距離為3時，各產地丹參均被單獨分為一類，表明不同產地丹參之間存在明顯差異。結果如圖1所示。

圖1 不同產地丹參無機元素聚類分析樹狀圖

2.7.2 根際土壤元素與丹參元素相關性分析

運用SPSS Statistics 22.0分析軟件Pearson分析根際土壤和丹參元素含量相關性，見表7。結果顯示根際土壤中的Fe、K元素與藥材中的K元素存在正相關關系，根際土壤中Na、Mn和Zn元素與藥材中Mn元素含量呈現(xiàn)正相關關系；根際土壤中Mg、K、Ca元素與藥材中Ca元素含量與呈正相關關系，但Mn、Zn元素含量與藥材中Ca元素呈現(xiàn)負相關；另外根際土壤中Mn、Zn元素含量與藥材中Mg、Ca、Mn有一定的相關關系。

表7 根際土壤元素與藥材間元素相關性分析

2.7.3 不同產地丹參元素主成分分析

運用SPSS Statistics 22.0分析軟件對不同產地丹參8種元素含量標準化處理后進行主成分分析，見表8和表9。主成分特征值大于1的因子有2.738，2.231和1.756，總貢獻率84.058%，可代表丹參樣品大部分信息。故選擇對該三個主成分進行分析，第一主成分特征根2.738，貢獻率為34.220%，元素Fe、Cu、Zn在第一主成分有較高載荷，反映此三種元素信息；第二主成分特征根2.231，貢獻率為27.887%，元素Na、K、Mn在第二主成分有較高載荷，反映此三種元素信息；第三主成分特征根1.756，貢獻率為21.951%，元素Mg和Ca在第三主成分有較高載荷，反映此二種元素信息。

表8 主成分分析的特征值和貢獻率

表9 初始因子載荷矩陣

根據(jù)主成分得分計算綜合得分，綜合得分越高藥材品質越高，綜合得分以主成分的貢獻率對主成分得分進行加權平均，即主成分總和得分=(主成分1得分×34.220+主成分2得分×27.887+主成分3得分×21.951)/84.058。結果顯示S8，S9和S10樣品綜合得分明顯高于其他，若以這八種元素作為評定指標，則山東產丹參質量較優(yōu)，具體見表10。

表10 不同產地丹參主成分得分和綜合得分

2.7.4 不同產地丹參元素偏最小二乘判別分析(PLS-DA)

為了進一步篩選不同產地丹參樣品質量差異的元素，采用SIMCA14.1軟件分別對不同產地丹參樣品的元素含量進行PLS-DA分析，得到變量重要性投影值圖(variable important project，VIP)，見圖2—圖4。其中橫坐標為無機元素編號，縱坐標為VIP值，VIP值越高，對模型貢獻率越高，由此篩選VIP值>1的元素，結果顯示對整體模型差異貢獻由大向小排序為Na，K，F(xiàn)e和Mg，推測以上無機元素可能是造成不同產地丹參質量差異的主要影響因素。

圖2 散點圖

圖3 模型驗證圖

圖4 VIP圖

3 結 論

藥用植物的生長發(fā)育和成分合成積累與生態(tài)環(huán)境關系密切，其中土壤是形成中藥材產量高及質量優(yōu)的基礎，土壤的質地、pH值及有機物質等指標對植物的根系活力和生長分布有著重要影響，研究驗證土壤質地直接影響根類中藥材的質量品質[13]。由中藥材資源調查結果顯示四川、山東、河南、陜西、山西為丹參的主產區(qū)[14]，本研究以5個省份9產區(qū)的丹參及根際土壤為樣品，建立原子吸收分光光度法測定樣品中無機元素含量，含量測定結果顯示四川丹參樣品中Fe、K元素含量較高，且該地區(qū)土壤以黏壤土為主，在黏壤土中內部陽離子大量交換使得土質中鉀元素較為豐富，本實驗結果與之吻合。

中藥材質量品質和臨床療效與生長區(qū)域環(huán)境息息相關，因土壤、氣候、產區(qū)等生態(tài)因子差異而發(fā)生成分轉化規(guī)律和物質積累變化是現(xiàn)研究階段值得探索的問題。以各無機元素含量為依據(jù)對5個產地各樣品進行聚類分析，結果顯示河南和陜西丹參被分為一類，山東、山西丹參分為一類，四川單獨成類，其分類結果表示道地產區(qū)分布與土壤質地差異有一定關聯(lián)性。另外發(fā)現(xiàn)，丹參根際土壤中的K，Na，Mn和Zn元素與藥材中多個無機元素呈現(xiàn)相關關系，且丹參藥材中Na，K，F(xiàn)e和Mg無機元素可能是導致不同產地丹參質量差異的主要影響因素。在種植過程中是否可以對根際土壤或植株葉面進行相關元素肥料的噴施，通過控制用量或配比來改善丹參藥材產量和質量，以期全面提升中藥材品質，是值得探討且深入研究的課題。

生態(tài)環(huán)境土壤是產生藥材道地差異主要因子之一，創(chuàng)造良好的土壤環(huán)境改良土壤性狀，提供適合不同中藥植物生長發(fā)育的土壤條件，是加強中藥材生產種植培優(yōu)技術的關鍵。本研究通過原子吸收分光光度法對不同產地丹參及根際土壤的無機元素進行測定，以期為丹參質量控制和品質評價相關研究提供參考，然而本研究就土壤和藥材中元素成分進行了探討，后期會結合化學成分和藥效活性進行全面研究，以期為藥材質量控制和評價提供參考。