地黃藥材的紅外指紋圖譜及多元統計分析

張維方，樊克鋒，雷敬衛*，紀 亮

1.河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450046 2.河南省中藥質量控制與評價工程技術研究中心，河南 鄭州 450046 3.河南牧業經濟學院動物醫藥學院，河南 鄭州 450046

引 言

中藥地黃為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的新鮮或干燥塊根[1]；始載于《神農本草經》，被列為上品，具有補血滋陰、清熱生津、涼血止血、益精填髓等功效[2]。生地黃是將地黃新鮮或干燥塊根緩緩烘焙至約八成干所得，生地黃性味甘、寒，歸、心、肝、腎經，具有清熱涼血，養陰生津等功效，用于溫毒發斑、熱入營血等癥。地黃主要產于河南、山東、山西、河北等地，由“今人惟以懷慶地黃為上，亦各處隨時興廢不同爾”等本草考證可知，河南作為地黃道地產區的地位沒有動搖，故河南產地黃亦稱為懷地黃，是我國著名的“四大懷藥”之一，主產于河南溫縣、博愛、武陟、沁陽、孟州等地[3]。目前多運用HPLC技術對于地黃化學成分和質量進行定性和定量鑒別[4]，此方法需要復雜的樣品前處理且周期較長，而傅里葉變換紅外光譜法，避免了復雜的樣品前處理，最大限度保留藥材的原始信息，可以實現對藥材的快速、無損檢測[5]。

中藥是復雜的混合物體系，其紅外光譜圖呈現出混合物體系中其各種成分的疊加譜，在同一峰位處，每種成分中只要具有相同的基團或者官能團，都會在此峰位處有一定的吸收[6]。因此，光譜圖中的每個峰，都不僅代表一種物質，而是多種物質的疊合峰，此光譜圖也就構成了圖譜的宏觀“指紋”性，同時也具有整體性特點，憑借其整體宏觀“指紋”性特征，可直接或間接進行中藥的鑒定鑒別與質量評價[7]。IR光譜具有整體性，客觀性和科學性，可全面反映藥材質量，化學計量學可以數字化的表達光譜信息，兩者結合可更加客觀地評價中藥材的質量[9]。本研究采用紅外光譜技術，建立不同產地生地黃的紅外指紋圖譜，結合正態分布分析、聚類分析(CA)和主成分分析(PCA)鑒別不同產地生地黃，為快速鑒別地黃、控制質量提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

傅里葉變換紅外分光光度計為Spectrum 100 型(美國Pekin Elmer公司)；紅外分析采用Spectrum for window3.02軟件；粉末壓片機為FW-4A型(天津市拓撲儀器有限公司)；FW-100型高速萬能粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司)；101-3AB型點熱恒溫鼓風干燥箱(北京中興偉業儀器有限公司)；ME204E/OL型萬分之一天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；溴化鉀(光譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；無水乙醇(分析純，天津市致遠化學試劑有限公司)；瑪瑙研缽。

1.2 樣品采集

43批地黃藥材(編號：S1—S43)，經河南中醫藥大學藥學院陳隨清教授鑒定為玄參科植物地黃(R.glutinosaLibosch.)的干燥塊根，30批河南產地黃藥材(編號：S44—S73)，經河南中醫藥大學藥學院陳隨清教授鑒定為河南產懷地黃。取地黃藥材樣品洗凈，于電熱鼓風干燥箱中55 ℃烘干，樣品粉碎，過200目篩，放入干燥器中備用。藥材樣品信息來源見表1。

表1 樣品信息表

1.3 紅外光譜采集

取樣品2 mg與120 mg KBr置于瑪瑙研缽研磨均勻，取適量混合均勻的樣品置于專用壓片模具中，以8 MPa壓力壓制30 s，壓成均勻半透明的薄片，然后將薄片放置于紅外燈下保持樣品片干燥，采用紅外光譜儀采集各樣品紅外光譜圖。光譜范圍4 000～450 cm-1，每張光譜掃描次數16次·s-1，光譜分辨率為4 cm-1，掃描速度0.2 cm·s-1，掃描時扣除CO2和H2O，室溫20～25 ℃，相對濕度為25%～35%。

1.4 數據處理

將各樣品紅外原始光譜用Spectrum for window3.02軟件進行處理，分別進行基線校正、歸一化處理并計算紅外光譜相對峰高，以不同產地地黃的相對峰高為原始數據使用SPSS19.0軟件對不同產地地黃進行聚類分析及主成分分析。

2 結果與討論

2.1 不同產地地黃紅外光譜分析

取不同產地地黃樣品按照1.3節壓制樣品片并掃描其紅外光譜。從不同產地生地黃紅外光譜圖可看出，其紅外光譜指紋圖譜峰形、峰位、峰高基本相似，不同產地地黃中含有相同的化學成分，所含的特征峰、形狀基本一致，其中河南產地有個別特征峰的高度突出，指紋區存在一定差異，如圖1所示。

圖1 不同產地生地黃紅外透過率疊加光譜

圖2 各產地生地黃紅外吸光度平均圖譜

2.2 正態分布分析

運用Spectrum for window3.02軟件將最初得到的紅外光譜圖由透過率T%轉換成吸光度A，再依次進行基線校正，因生地黃中糖苷類成分最多，故選擇1 200～900 cm-1波段范圍內的最高峰歸一處理，再分別計算特征峰相對峰高，如圖3所示。得到一系列相關峰相對峰強值，經過對這些相對峰強度值去除離散值后，因河南為地黃的道地產區，對河南產的懷地黃(S44—S73)與其他省份(S1—S43)中各個省份地黃進行比較，利用正態分布曲線圖進行輔助分析，如圖4(a, b, c)所示，發現在1 639 cm-1處，河南產的懷地黃與其他省份的正態分布曲線交叉依次為：山東省>山西省>河北省，因此本方法能很好地將道地藥材與非道地藥材區分開。

圖3 不同產地生地黃的相對峰高

圖4 不同產地生地黃正態分布曲線圖

2.3 聚類分析

運用Spectrum for window3.02軟件將所采集的紅外原始光譜由透過率T%轉換成吸光度A，進行自動基線校正，自動平滑處理。選擇1 200～900 cm-1波段范圍內的最高峰的吸光度歸一化處理，計算13個特征峰的峰強度。以73批不同產地地黃樣品的13個特征峰的相對峰強度為原始數據，將數據輸入SPSS19.0軟件，采用組間連接法，以平方Euclidean距離為分類依據，橫坐標為組間距離，縱坐標為樣品編號，對樣品進行系統聚類分析，結果見圖5。當組間距離=10時，各省地黃基本上各自聚為一類，其中山東省生地黃(S38—S43)與山西生地黃(S9—S37)明顯各自聚為一類；當組間距離=15時，不同產地生地黃藥材可聚為2類，S1—S43聚為一類，S44—S73聚為一類即懷地黃聚為一類，山西、山東、河北等地的地黃藥材聚為一類，說明河南產的懷地黃內部質量與山西、山東、河北的地黃藥材存在一定差異。

圖5 聚類分析樹狀圖

2.4 主成分分析

主成分分析是從多個變量之間的聯系入手，利用降維思想，將多個變量轉化為少數幾個互不相關、能反映原始變量信息變量的統計分析方法，在指紋圖譜研究中具有簡明、準確等優點。以73批地黃樣品13個共有峰相對峰強度為原始數據，運用SPSS19.0軟件標準化處理進行降維因子分析，主成分特征值及方差貢獻率見表2，因前兩個因子累計方差貢獻率為87.101%>85%，充分代表了地黃樣品13個共有峰的基本特征和主要信息，故選取其中特征值大于1的前2個主成分特征值分別為9.398和1.925因子作為主成分1、主成分2。由圖6可見前2個因子斜率陡峭，后趨于平緩，可將前2個因子作為主成分。

圖6 主因子碎石圖

表2 主成分特征值及方差貢獻率

主成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻大小和作用方向，將各特征向量中心化和標準化后，73批樣品的主成分得分圖(圖7)，河南產地黃樣品與主成分1均呈正相關，與主成分2大體呈正相關；山東產地地黃樣品與主成分1呈負相關，與主成分2大體呈正相關；山西產地地黃樣品與主成分1部分呈正相關，與主成分2均呈負相關；河北產地地黃樣品與主成分1呈負相關，與主成分2呈正相關。綜合得分計算是以主成分的貢獻率為權數對主成分得分進行加權平均，即：主成分綜合得分=(72.291×主成分1得分+14.810×主成分2得分)/87.101。對73批地黃樣品主成分綜合得分進行降序排列，綜合得分越高表明藥材質量越好[9]。如表3所示，主成分綜合得分排序河南產地地黃主成分得分排名最為靠前，其次為山西運城地黃，排名最后的為山東產地地黃，表明地黃質量最好的為河南產區，山西產區次之，結合表3、圖7可知對于地黃品質影響較大的為主成分1。

表3 主成分綜合得分排序表

圖7 不同產地地黃2個主成分的排序坐標圖

3 結 論

傅里葉變換紅外光譜分析避免了復雜的樣品前處理過程，紅外光譜作為分子結構分析方法之一，是官能團結構解析、未知物結構鑒定及其偽造摻假鑒別等的重要方法。紅外光譜特征的信息整體性表征復雜混合物體系化學成分的復雜多樣性。根據生地黃的化學成分特征來確定它的主成分特征峰和與其對應的特征波段, 確認具有的特征吸收峰(峰位置、峰形狀以及相對峰高)。將地黃圖譜進行基本處理后，對1 200～900 cm-1進行歸一化處理，共標定13個共有峰，對其進行相對峰高的計算后，發現1 639 cm-1處河南產懷地黃峰高均值>0.45、1 424 cm-1處河南產懷地黃峰高均值≥0.55、1 354 cm-1處河南產懷地黃峰高均值>0.45和1 260 cm-1處河南產懷地黃峰高均值≥0.37，其他產地地黃這四個相對峰高均低于河南產懷地黃，可以此4個峰高為參考依據來區分懷地黃與其他地黃。

在不同產地中，河南產的懷地黃與其他省份地黃的圖譜比較中，其光譜圖均有“菩薩身”紅外特征峰吸收。但因生長過程中不同的氣候、溫度、濕度、光照時間、土壤性質(例如酸堿性等、施肥、加工)等條件的影響，其質量就會存在較大的差異。1 900～1 750 cm-1(主要為酯類)、1 700～1 500 cm-1(主要為酸類)和1 200～950 cm-1(主要為糖類)范圍內的振動吸收均有差別，主要就是在同一年限不同產地的條件下，由于各個地方氣候、濕度、溫度、土壤性質等等一系列條件的影響，進而導致各個產地地黃中所含大分子物質酯、酸、糖的相對含量各有不同，最后在紅外吸收光譜圖中表現出同一峰位處峰的相對強弱。紅外指紋圖譜結合正態分布、聚類分析和主成分分析為地黃的道地性檢驗提供了便捷的方法，也為地黃資源的綜合開發提供參考。