精脒對衰老兔骨髓間充質干細胞成骨分化的影響及機制研究

張廣維，侯 穎，吳方麗，畢麗霞，李 爽，黨瑞杰，田蕭羽，朱 彪 火箭軍特色醫學中心 口腔科，北京 00088； 首都醫科大學附屬復興醫院 口腔科，北京 0008； 解放軍總醫院第一醫學中心 口腔科，北京 0085

隨著全球人口老齡化的快速發展，老年性骨質疏松癥患病率逐年升高，已成為嚴重威脅人類生存健康的重大公共衛生問題之一[1]。老年性骨質疏松是口腔種植手術的相對禁忌，改善老年性骨質疏松癥對于提高種植手術成功率具有重要意義[2]。骨髓間充質干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨形成的重要細胞來源[3]。促進BMSCs向成骨細胞分化是改善老年性骨質疏松的重要手段。在機體衰老進程中，BMSCs也表現出增殖緩慢、生長停滯并喪失分化能力等特征[4]。多胺是一類廣泛分布于哺乳動物細胞內的脂肪族小分子化合物，包括腐胺、精胺和精脒(Spermidine)等[5-6]。動物實驗發現，Spermidine可延長老齡小鼠的壽命且具有心臟保護功能；臨床試驗也表明，Spermidine可降低血壓并減少心血管疾病的患病率[7]。但Spermidine能否促進衰老BMSCs成骨分化尚不清楚。因此，本研究擬探討Spermidine對衰老兔BMSCs成骨分化的影響及其作用機制，為臨床改善老年性骨質疏松提供實驗基礎。

材料與方法

1 細胞、試劑與儀器 凍存的新西蘭大白兔BMSCs(解放軍總醫院轉化醫學中心實驗室)；D-半乳糖組(D-galactose，D-gal；北京索萊寶科技有限公司)；Spermidine(美國Sigma公司)；α-MEM培養基(美國Gibco公司)；MTT(國藥集團)；成骨誘導液(蘇州賽業生物科技有限公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰酶、錐蟲藍(美國Sigma公司)；青霉素及鏈霉素(石家莊華北制藥)；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)/還原型NAD+(NADH)試劑盒(上海碧云天生物)；Sirt1抗體(貨號：Sc-15404，稀釋比例1∶300；美國Santa cruz公司)；β-actin抗體(貨號：BM0627，稀釋比例1∶200；武漢博士德生物工程有限公司)及山羊抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology公司)；CD11b、CD44、CD45、CD31、CD34、CD73、CD90、CD105、CD29抗體(美國BD公司)；BCA測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)。Herocell 180型CO2恒溫培養箱(上海潤度生物科技有限公司)；SW-CJ-1FD型生物凈化工作臺(蘇州安泰)；TD5K-Ⅱ型低速離心機(長沙東旺實驗儀器)；Biophotometer核酸蛋白測定儀(德國Eppendorf公司)；CytoFLEX型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉膜儀(北京六一儀器廠)；LW300LFT型正置 熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 流式細胞術鑒定BMSCs表型 復蘇培養兔BMSCs，采用0.5%胰酶消化第3代BMSCs制成單細胞懸液備用。于BMSCs單細胞懸液中分別加入熒光標記的抗CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105抗體[8]，4℃避光孵育30 min。PBS緩沖液洗去未結合的抗體 ，上機檢測并用FlowJo軟件進行數據分析。

3 NAD+/NADH比例測定 將第3代BMSCs分為3組：對照組(Vehicle，培養基中不加入任何藥物)，D-gal誘導衰老組(培養基中加入40 g/L D-gal誘導BMSCs衰老)，Spermidine組(培養基中加入40 g/L D-gal + 3 μmol/L Spermidine處理BMSCs)。加藥后各組細胞繼續培養3 d，倒掉培養板中的培養液，每孔加入200 μL NAD+/NADH提取液，輕輕震蕩培養板促使細胞裂解。測定NAD+&NADH時，20 μL NAD+/NADH提取液加入90 μL現配的乙醇脫氫酶工作液，37℃避光孵育10 min(在無CO2的環境中操作)，再加入10 μL顯色液避光孵育30 min，于酶標儀450 nm處檢測吸光度值。測定NADH時，首先將NAD+/NADH提取液于60℃下水浴30 min，其余實驗步驟同測定NAD+&NADH。N AD+/NADH=(NAD+&NADH-NADH)/NADH。

4 MTT法檢測細胞增殖活性 將Vehicle組、Dgal誘導衰老組和Spermidine組細胞以1.0 × 103/孔的密度接種于96孔板，接種后連續9 d測定細胞的增殖活性。測定時，每孔加入20 μL 5% MTT溶液，繼續培養4 h。吸出培養液，每孔加入100 μL DMSO，置搖床上振蕩10 min，于酶標儀492 nm處 檢測吸光值。

5 Western blot檢測Sirt1蛋白的表達 將Vehicle組、D-gal誘導衰老組和Spermidine組細胞成骨誘導7 d后檢測Sirt1的表達。以β-actin為內參，檢測 實驗步驟參照文獻[9-10]。

6 qPCR檢 測 成 骨 相 關 基 因 的 轉 錄 表 達 將Vehicle組、D-gal誘導衰老組、Spermidine組、Sirt1基因沉默組(Si Sirt1，40 g/L D-gal + 3 μmol/L Spermidine + 50 nmol/L siRNA Sirt1)和基因沉默對照 組(Si Control，40 g/L D-gal + 3 μmol/L Spermidine + 50 nmol/L siRNA Control)細胞成骨誘導培養7 d后提取RNA。然后檢測Runt相關轉錄因子(runt-related transcription factor 2，Runx2)、鋅指結構轉錄因子(osterix，Osx)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)的轉錄表達。基因引物由上海申工合成，序列 見表1。

表1 成骨相關基因引物序列Tab. 1 Primer sequences of osteogenic genes

7 統計學處理 使用SPSS 26.0軟件進行數據處理，正態分布的計量資料以 x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，如果方差齊采用LSD法進一步比較，如果方差不齊采用Tamhane’s T2法進一步比較。方差齊性檢驗采用Levene’s檢驗，檢驗 水準α=0.1。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 體外衰老兔BMSCs細胞模型的建立 流式細胞術結果顯示(圖1A)，BMSCs低表達造血干細胞表面標志物CD11b(4.84%)、CD31(1.09%)、CD34(1.23%)和CD45(3.72%)；高表達間充質干細胞表面標志物CD29(99.0%)、CD44(99.6%)、CD73(91.9%)、CD90(99.4%)和CD105(99.5%)。上述實驗結果表明，我們成功分離并培養出了兔BMSCs。細胞內NAD+/NADH水平下降是細胞衰老的一個重要特征。圖1B顯示，與Vehicle組相比，D-gal誘導衰老組BMSCs細胞內NAD+/NADH比例顯著降 低，這表明采用D-gal成功誘導兔BMSCs衰老。

圖1 兔BMSCs細胞衰老模型的建立A：兔BMSCs細胞表面標志物的鑒定；B：BMSCs細胞NAD+/NADH比例(aP < 0.05，vs Vehicle組；bP < 0.05，vs D-gal組)Fig.1 Cell senescence modeling of rabbit BMSCs A: Flow cytometric analysis of surface markers of rabbit BMSCs; B：NAD+/NADH (aP < 0.05, vs vehicle group; bP <0.05, vs D-gal group)

2 Spermidine對衰老BMSCs細胞增殖的影響 如圖2所示，各組細胞的生長曲線均呈“S”形。與Vehicle組相比、D-gal誘導衰老組BMSCs的增殖活性顯著降低。在培養的第8天BMSCs的增殖活性達到峰值；Spermidine干預可顯著提高衰老B MSCs的增殖活性。

圖2 Spermidine對衰老BMSCs細胞增殖的影響(aP < 0.05, vs Vehicle組; bP < 0.05, vs D-gal組)Fig.2 Effect of spermidine on senescent BMSCs growth (aP < 0.05,vs vehicle group; bP < 0.05, vs D-gal group)

3 Spermidine對Sirt1蛋白表達的影響 如圖3所示，在成骨分化的過程中，與Vehicle組相比，D-gal誘導衰老組BMSCs細胞內Sirt1蛋白的表達顯著降低(P＜0.05)，而Spermidine組衰老BMSCs細 胞內Sirt1表達有升高的趨勢。

圖3 Spermidine對衰老BMSCs細胞內Sirt1表達的影響(aP <0.05, vs Vehicle組)Fig.3 Effect of spermidine on Sirt1 expression in senescent BMSCs(aP < 0.05, vs vehicle group)

4 Spermidine對成骨相關基因轉錄表達的影響 如圖4所示，在BMSCs成骨分化的過程中，與Vehicle組相比，D-gal組成骨相關基因Runx2、Osx和ALP的轉錄水平明顯下調(P＜0.05)；而Spermidine干預可提高Runx2、Osx和ALP的轉錄表達水平(P＜0.05)；當使用siRNA抑制Sirt1蛋白的表達后，Spermidine上調Runx2、Osx和A LP的轉錄表達的作用明顯減弱(P＜0.05)。

圖4 Spermidine對成骨相關基因轉錄表達的影響(aP < 0.05, vs Vehicle組; bP < 0.05, vs D-gal組；cP < 0.05, vs Spermidine組)Fig.4 Effect of spermidine on osteogenic gene expression (aP < 0.05, vs vehicle group; bP < 0.05, vs D-gal group, cP < 0.05, vs spermidine group)

討 論

本研究首次發現，Spermidine可提高衰老BMSCs細胞內NAD+/NADH水平，促進衰老BMSCs增殖與成骨分化。Spermidine促進衰老BMSCs成骨分化的作用與激活Sirt1有關。

NAD+是活細胞內糖酵解、三羧酸循環和氧化磷酸化等代謝途徑中脫氫酶的輔酶，具有傳遞氫和電子的功能[11]。NAD+廣泛參與機體物質與能量代謝、DNA損傷修復等生理或病理過程的調節[12]。本研究發現，衰老BMSCs細胞內的NAD+/NADH比例下降，而Spermidine可提高細胞內NAD+/NADH水平。同時，NAD+也是多種NAD+依賴性水解酶的底物，如Sirt1與CD38等[13]。細胞內NAD+/NADH比例升高可激活Sirt1。Sirt1這種NAD+依賴性的去乙?；冈谒ダ系倪^程中表達下調，而且Sirt1是抗衰老的關鍵酶之一[14]，激活Sirt1可改善高脂飲食小鼠的壽命并提高其生活質量[15]。本研究在發現Spermidine可提高衰老BMSCs細胞內NAD+/NADH水平的基礎上進一步證實Spermidine可在某種程度上恢復衰老細胞內Sirt1蛋白的表達水平。

增殖能力下降是細胞衰老的一個主要表型[16]。本研究顯示，D-gal誘導衰老后BMSCs增殖能力顯著下降，而Spermidine可提高衰老BMSCs的增殖能力。既往研究也發現，采用多胺合成的限速酶鳥氨酸脫羧酶抑制劑α-二氟甲基鳥氨酸降低細胞內的腐胺和Spermidine水平后，BMSCs的增殖能力顯著下降[17]，這與本研究中MTT檢測BMSCs增殖活性的實驗結果一致。成骨分化能力下降是BMSCs衰老的另一個重要表型[18]。本研究qPCR結果顯示，D-gal誘導后BMSCs成骨分化能力減弱，而Spermidine可提高衰老BMSCs的成骨分化能力。且抑制Sirt1后，Spermidine提高衰老BMSCs成骨分化能力的作用明顯減弱，說明Spermidine提高衰老BMSCs成骨分化的能力部分是通過激活Sirt1實現的。

D-gal是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的單糖，在衰老研究中被用于誘導衰老[19]。文獻報道，D-gal誘導衰老的主要機制是誘導細胞內的氧化應激損傷[4,20-21]。但本研究未進一步驗證Spermidine提高衰老BMSCs成骨分化的能力是否與緩解細胞內的氧化應激損傷有關，這是本研究的一個局限。氧化應激損傷在Spermidine提高衰老BMSCs成骨分化能力中的作用值得深入探討。

綜上所述，本研究發現Spermidine可在體外提高衰老BMSCs的成骨分化能力，且這種作用與激活Sirt1有關。