口服丙酮酸鈣鹽糖液對重度燒傷大鼠傷后早期氧合臟器功能及生存率的影響

劉翔宇，柴家科，劉 甜，黃健翔，曲毅睿，胡吉林，胡方超，遲云飛，暢 陽解放軍總醫院研究生院，北京 100853； 解放軍總醫院第四醫學中心 全軍燒傷研究所，北京 100048

嚴重燒傷休克是燒傷患者早期常見的死亡原因[1]。盡早止血和給予液體復蘇是救治休克的關鍵措施。有統計結果表明，液體復蘇實施的越早，救治存活概率就越大[2]。但在災害現場搶救中，因場地受限、醫療資源缺乏，靜脈補液難以立即展開，導致傷員并發癥及死亡率大大增加。在無靜脈補液條件下，口服補液是一種高效的復蘇手段。近年來研究表明采用丙酮酸鹽救治燒傷導致的低血容量休克療效較好[3-6]。丙酮酸鹽與胃酸作用可生成具有抗休克作用的丙酮酸根，其進入機體可提高組織和細胞對缺氧環境的耐受性，抑制細胞凋亡，保護重要臟器器官功能，抗休克效果優于WHO推薦的口服補液鹽[7]。但目前研究最多且最常用的丙酮酸鹽——丙酮酸鈉口服安全性低，這使其口服制劑向臨床過渡面臨重重困難。丙酮酸鈣是丙酮酸的鈣鹽，廣泛存在于蘋果、奶酷黑碑、紅酒等食品中，其食字號產品已上市，食用安全性高，可使丙酮酸安全進入機體發揮抗休克作用，所以丙酮酸鈣應用于口服液體復蘇具有廣闊前景。目前國內外尚無丙酮酸鈣用于抗休克的相關研究，其復蘇效果還不完全清楚。基于以上研究背景，本實驗將丙酮酸鈣引入經典的WHO口服補液鹽Ⅲ中，配制出了新型丙酮酸鈣鹽糖液，探討其對重度燒傷后早期缺血缺氧狀態、抗氧化能力、臟器功能及生存率的影響；將口服丙酮酸鈣鹽糖液與腹腔補乳酸鹽林格液的療效進行對比，初步評價其在院前急救階段復蘇中的應用價值。

材料與方法

1 實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠210只，6～8周齡，體質量210～230 g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。在解放軍總醫院第四醫學中心動物實驗室恒溫(25±3)℃、恒濕(50±5)%條件下適應性飼養1周，實驗前禁食12 h，禁水4 h。本研究經解放軍 總醫院實驗動物倫理委員會批準。

2 主要儀器及試劑 便攜式血氣分析儀(OPTI Medical公司，美國)；VT-5600自動生化分析儀(強生公司，美國)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒、二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測試盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；乳酸鹽林格液購自國藥控 股北京天星普信生物醫藥有限公司。

3 口服液體配制方法 丙酮酸鈣鹽糖液配制：參照文獻[8]中的方法配制丙酮酸鈣鹽糖液：取WHO推薦的口服補液鹽Ⅲ 4包，稱量6.8 g丙酮酸鈣，溶于1 000 mL飲用水中，每次現用現配，使 用前置于37℃恒溫水浴箱預熱。

4 動物模型制備與分組 選取130只雄性Wistar大鼠(6-8周齡)，按照隨機數字表法分為假傷組(Sham組，n=30)、單純燒傷組(Burn組，n=60)、口服補液組(OR組，n=60)和腹腔補液組(PR組，n=60)。Sham組(n=30)大鼠用3%戊巴比妥按照40 mg/kg的劑量麻醉后，37℃水浴浸泡背部12 s，腹部6 s；其余三組(每組60只)大鼠用3%戊巴比妥以同樣劑量麻醉后，94℃沸水浸泡背部12 s、腹部6 s，致50%總體表面積Ⅲ度燒傷(經病理切片證實，為嚴重燒傷)[9-11]。OR組采用灌胃輸入丙酮酸鈣鹽糖液的方法口服補液，PR組采用腹腔注射乳酸鹽林格液的方法腹腔補液，兩組均于傷后即刻開始補液。補液量和速度依據Parkland公式(燒傷后第一個24 h補液量=體質量(kg) × 燒傷面積(%) × 4 mL，前8 h補液量為第一個24 h補液量的一半)，每2 h嚴格按照計算所得補液量進行補液，總共補液8 h。Sham組自由飲水，Burn組不 予補液。8 h后各組均自由進食水，不再補液。

5 生存率觀察 每組各取20只大鼠，觀察24 h，每30 min觀察1次，詳細記錄動物的狀態和死亡時 間，計算各組大鼠生存率。

6 相關指標及病理檢測 選取造模后0.5 h、4 h、8 h、24 h四個時間點，每個時間點從各組選取10只大鼠采集腹主動脈血，用便攜式血氣分析儀測量血氣分析指標，包括pH值、動脈血氧分壓(partial pressure of oxygen in artery，PaO2)、動脈血二 氧 化 碳 分 壓(partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)、剩余堿(base excess，BE)、血乳酸(lactic acid，Lac)；用自動生化分析儀測量臟器功能指標，包括谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、血肌酐(serum creatinine，CR)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)；用Elisa法測量氧化應激指標，包括MDA、DAO、SOD、T-AOC；取心、肝 、肺部分組織行HE染色檢測組織病理變化。

7 統計學方法 采用SPSS23.0統計軟件，計量資料以 x ˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析和兩獨立樣本t檢驗。計數資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為 差異有統計學意義。

結 果

1 造模情況 大鼠造模后無死亡。在各時間點放血處死大鼠后，取背部和腹部燒傷區域皮膚進行病理檢測，病理結果證實燒傷深度符合建模要 求。

2 各組生存率比較 傷后24 h內，Sham組生存率100%。傷后8 h，OR組生存率(70%)與PR組生存率(75%)差異無統計學意義(χ2=0.18，P＞0.05)，且均高于Burn組的55%(χ2=0.64、1.58，P＞0.05)。傷后24 h，OR組生存率(70%)與PR組生存率(75%)均顯著高于Burn組(30%)，差異均有統計學意義(χ2=4.37、6.54，P＜0.05)。K aplan-Meier生存曲線見圖1。

圖1 各組重度燒傷大鼠Kaplan-Meier生存曲線圖Fig.1 Kaplan-Meier survival curves of severely burned rats in each group

3 血氣分析指標 1)pH值：傷后0.5 h，三個致傷組pH值均降低，4 h后均回升至正常范圍，四組pH值差異均無統計學意義(P＞0.05)。傷后8 h、24 h，Burn組pH值明顯下降，其他三組pH值均在正常范圍內，Burn組與其他三組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)(表1)。2)PaO2：傷后0.5 h，Burn組、OR組、PR組氧分壓均低于Sham組(P＜0.05)。傷后24 h，Burn組氧分壓明顯降低，與其他三組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)(表1)。3)PaCO2：傷后0.5 h，三個致傷組均降低，與Sham組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。傷后4 h、8 h、24 h，Burn組PaCO2明顯增高，各時間點與其他三組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)(表1)。4)BE：傷后0.5 h，三個致傷組BE負值明顯增大。傷后4 h、8 h，OR組和PR組BE負值呈現逐漸減小的趨勢，Burn組BE逐漸增大，與OR和PR組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)(表1)。5)Lac：傷 后4 h、8 h、24 h，Burn組血乳酸值明顯升高，各時間點與其他三組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。傷后4 h、24 h，OR組和PR組Lac值高于Sham組(P＜0.05)(表1)。

表1 各組大鼠各時間點血氣分析指標比較(n=10)Tab. 1 Comparison of blood gas analysis indexes of rats in each group at each time point (n=10)

4 各組臟器功能指標比較 1)ALT：三個致傷組均逐漸升高，但四個時間點三組間比較差異均無統計學意義(表2)。2)AST：傷后0.5 h，三個致傷組均升高，PR組增幅最大，與OR組比較差異有統計學意義(P＜0.05)(表2)。3)CR：傷后4 h，三個致傷組均明顯高于Sham組(P＜0.05)；傷后8 h、24 h，三個致傷組CR值均下降，Burn組高于其他三組(P＜0.05)(表2)。4)BUN：傷后0.5 h、4 h、8 h、24 h，三 個 致 傷 組 均 高 于Sham組(P＜0.05)；傷后4 h、8 h、24 h，Burn組BUN值逐漸升高，而OR組、PR組BUN值逐漸下降(表2)。5)CK-MB：傷后0.5 h、4 h、8 h、24 h，三個致傷組均高于Sham組(P＜0.05)；傷后8 h、24 h，Burn組CK-MB值高于OR組、PR組(P＜0 .05)(表2)。

表2 各組大鼠各時間點臟器功能指標比較(n=10)Tab. 2 Comparison of organ function indexes of rats in each group at each time point (n=10)

5 各組氧化應激指標比較 1)MDA：傷后4 h，三個致傷組MDA值明顯高于Sham組(P＜0.05)；傷后8 h，三組MDA值均降低，但仍高于Sham組，僅Burn組與Sham組比較差異有統計學意義(P＜0.05)(表3)。2)DAO：傷后0.5 h，Burn組和PR組DAO值高于Sham組(P＜0.05)；傷后4 h、8 h，Burn組DAO值逐漸升高，與其他各組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)；傷后24 h，四組DAO值組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)(表3)。3)SOD：傷后4 h、24 h，OR和PR組SOD值均明顯高于Sham組和Burn組(P＜0.05)(表3)。4)T-AOC：傷后8 h、24 h，OR組T-AOC值高于Burn組和PR組(P＜0.05)，與Sham組差異無統計 學意義(P＞0.05)(表3)。

6 各組大鼠組織病理學變化比較 1)Sham組大鼠心(圖2A)、肝、肺組織結構完整、清晰，無水腫、滲出及出血。2)Burn組在傷后0.5 h各組織即可見充血、水腫及炎癥細胞浸潤(圖2B)，且隨著時間的延長，上述病變逐漸加重并出現出血(圖2C)，傷后24 h可見心肌纖維排列紊亂、斷裂，間距增寬，心肌間質水腫、出血嚴重，心肌細胞腫脹(圖2A)；肺組織肺泡結構破壞，肺間質水腫、出血，肺泡壁明顯增厚，炎癥細胞滲出，肺泡腔內可見少量水腫液滲出；肝組織細胞明顯腫脹，肝竇間隙增寬，門脈區血管周圍帶肝細胞出現大量脂滴，可見小片狀溶解性壞死。3)PR組傷后0.5 h病理變化與Burn組差異不大，心尖組織可見心肌纖維間距增寬，少量心肌細胞腫脹(圖2D)，肝組織可見肝竇變窄，少量肝細胞發生脂肪樣變性，肺組織肺泡壁增厚，間質少量充血、水腫及炎癥細胞滲出，但隨著傷后時間的延長，PR組未發生明顯病情進展，未出現更嚴重的組織結構破壞(圖2E)。4)OR組傷后0.5 h的組織損傷程度與Burn組、PR組無明顯差異，可見心尖組織中少量心肌細胞腫脹及少量滲出(圖2F)，肝組織可見肝細胞腫脹及脂肪樣變性，肺組織肺泡壁稍增厚，間質少量充血、水腫及炎癥細胞滲出。在傷后4 h、8 h、24 h，OR組未發生明顯病情進展，未出現更嚴重的組織結構破壞(圖2G)。

圖2 大鼠心尖組織病理形態學觀察(HE染色，200×)A: Sham組心尖組織；B: Burn組傷后0.5 h心尖組織；C: Burn組傷后24 h心尖組織；D: OR組傷后0.5 h心尖組織；E:OR組傷后24 h心尖組織；F: PR組傷后0.5 h心尖組織；G：PR組傷后24 h心尖組織Fig.2 Pathomorphological observation of apical tissue of rats (HE staining, 200×)A: The apical tissue of Sham group; B: The apical tissue of Burn group at 0.5 h after injury; C: The apical tissue of Burn group at 24 h after injury; D: The apical tissue of OR group at 0.5 h after injury; E: The apical tissue of OR group at 24 h after injury; F: The apical tissue of PR group at 0.5 h after injury; G: The apical tissue of PR group at 24 h after injury

討 論

無靜脈補液條件下行口服補液具有以下優點：首先其配制簡單、攜帶方便；其次，對無菌的要求相對較低，且不需要靜脈穿刺、注射等醫學技能，將其用于戰場火線救治或災害現場急救，既可緩解醫療資源不足的壓力，又可節省救治時間[12-13]。目前，最常用的口服補液溶液是WHO推薦的以葡萄糖-電解質溶液為主要成分的ORS液，該溶液經口服后可被腸道有效吸收，在治療嚴重腹瀉方面效果良好[14]。有學者將其應用于燒傷休克的防治中，發現其存在一些不足：對休克缺血缺氧狀態改善不足，尤其是對乳酸性酸中毒狀況改善不足[8,15]。燒傷休克與其他休克不同的是在補充血容量的前提下，需要改善組織氧供[16]，所以有必要對ORS液進行改進，在達到擴容的前提下，提高組織耐氧，改善氧供。丙酮酸鹽在化工、食品和實驗醫學等領域應用廣泛，近年研究發現丙酮酸鈉可抑制燒傷及休克后腸上皮細胞緊密連接蛋白降低、氧自由基含量降低、HIF-1水平增加，保護和改善腸屏障功能及缺血再灌注損傷，并能改善嚴重感染、燒傷、多器官功能障礙綜合征等致死性動物模型的存活率[17-21]。但丙酮酸鈉目前尚無食字號的產品上市，口服安全性仍有待大量多中心的臨床研究進一步驗證，這使得其難以進一步廣泛應用于臨床。

本實驗采用已有食字號產品上市的丙酮酸鈣替代了丙酮酸鈉，制備了新的丙酮酸鈣鹽糖液。目前相關研究已證實燒傷體表總面積40%以下的動物經胃腸道補充丙酮酸鈉鹽糖液能被充分吸收[22]。燒傷體表總面積在40%以上時，胃腸道因嚴重缺血蠕動減弱，對口服補液的排空和吸收能力顯著降低，而直接影響口服補液治療的效果。胡森等[23]的研究證明50%體表總面積Ⅲ度燒傷犬口服葡萄糖-電解質液也可改善休克狀態，而針對口服丙酮酸鈣鹽糖液進行液體復蘇的研究尚未見國內外報道，在40%以上體表總面積燒傷傷情條件下其是否可改善休克狀態也并不明確，所以本實驗在50%體表總面積Ⅲ度燒傷的大鼠模型基礎上，對丙酮酸鈣鹽糖液的復蘇效果進行了初步探究。實驗結果顯示，在傷后0.5 h，三個燒傷組均呈現出氧合功能下降、臟器功能受損及氧化損傷加重等情況，傷后4 h、8 h，Burn組各項指標明顯惡化，即使在傷后8 h自由進食水，但也由于前期發生休克，機體缺血缺氧，臟器灌注不足，且氧化損傷較重，而導致傷后24 h各項指標恢復并不理想，且死亡率進一步增加。傷后4 h、8 h、24 h，OR組pH值、PaO2、BE、PaCO2、Lac、CR、BUN、CK-MB、MDA、DAO、SOD和T-AOC較Burn組均有明顯改善，組織病理可見組織損傷較Burn組明顯好轉，24 h生存率也明顯提高，且其肝功能指標ALT和AST均值也較Burn組有所下降，但差異并不明顯，針對肝功能的影響還需要后續進一步實驗驗證。

腹腔補液作為靜脈補液的另一種替代手段，近些年也受到廣泛關注。腹膜是人體面積最大的漿膜，其上密布毛細血管及淋巴管，具有強大的吸收能力和轉運能力[24]。近年來研究表明，腹腔補液可有效增加循環血量、組織灌注，減輕組織水腫及炎癥反應，應用于休克的救治具有廣泛前景[25-27]。本實驗也設置了腹腔補液組，并選取了臨床上最常用的復蘇液乳酸鹽林格液，擬比較口服補液和腹腔補液這兩種復蘇方式的復蘇效果。實驗結果顯示，OR組和PR組氧合指標、臟器功能指標、氧化應激指標及組織病理方面較單純燒傷組均有一定程度的改善，且二者起到的復蘇效果相似，PR組24 h生存率略高于OR組，但差異無統計學意義。且OR組前期死亡數量較多，多由于致傷后胃腸功能損傷使得口服復蘇液排空不暢、吸收不足。此外早期復蘇時麻醉尚未完全蘇醒，未蘇醒的大鼠給予口服補液易發生嘔吐現象，由此引發的反流誤吸也導致了OR組早期死亡率的增加。但在傷后2 h麻醉基本完全蘇醒后，OR組死亡率逐漸降低，傷后2 h至傷后8 h，OR組死亡率低于PR組。在復蘇效果方面，OR組還顯現出一些優勢。OR組血乳酸值傷后24 h各時間點均在正常值范圍內，且較PR組改善顯著；傷后各時間點三個燒傷組肝功能均異常，但在傷后8 h、24 h，OR組AST值明顯低于PR組；在氧化損傷指標方面，傷后8 h、24 h，OR組T-AOC較PR明顯升高。這些都表明口服新型丙酮酸鈣溶液在改善組織灌注、保護肝功能、提高機體抗氧化能力方面有其優勢，但其復蘇效果還需更多實驗來進一步證明。

本實驗仍存在一些不足：1)沒有進行血流動力學和尿量的相關監測，不能充分評估補液組有效循環血量是否充足；2)缺少致傷后胃排空功能和腸吸收功能的評價，隨著燒傷面積的增加及病情的加重，傷后胃腸道的吸收和排空功能均會進一步降低，還需進一步評估在50%重度燒傷條件下大鼠的胃排空和腸吸收功能變化，以確定傷后胃腸道的有效吸收量，進而可更有針對性的定量補液；3)選取的觀察時間點相對較短，只是初步的效果探索，且缺少對不同復蘇方式應用同種復蘇成分的效果比較。下一步還需選取同種液體成分進行研究，全面評價不同復蘇方式的差異，并擴大樣本量，延長觀察時間，在與人生理更加接近的大動物模型上做進一步的效果驗證，進而全面評價口服丙酮酸鈣溶液的復蘇療效。

綜上所述，本研究結果表明口服丙酮酸鈣鹽糖液可改善重度燒傷大鼠傷后的缺血缺氧狀態，改善氧合狀況并保護臟器功能，減輕臟器的氧自由基損傷，提高機體的抗氧化能力，提高重度燒傷大鼠24 h生存率，其與腹腔補充乳酸鹽林格液的復蘇效果相近，且在改善組織灌注、機體抗氧化能力等方面稍優于腹腔補充乳酸鹽林格液，用于災害現場的緊急救治具有廣泛前景。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。