一種多氯聯苯膠體金免疫快速檢測試紙條的研制

萬宇平，鄭百芹，賈芳芳，李愛軍，崔海峰，賈招閃，何方洋2，

（1.北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京 102206；3.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北 唐山 063000；4.灤州市農業農村局，河北 灤州 063799）

多氯聯苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）屬于鹵代芳烴類化合物，可作為樹脂、防火劑、涂料等多種工業品的添加劑[1-2]，是一種用途很廣的工業化學品。而該物質屬于致癌物，容易在人體的脂肪組織中積累，對神經系統、生殖系統、免疫系統均有危害作用；同時對水體和大氣環境均可造成污染[1-2]。雖然大多數國家已停止了生產和使用多氯聯苯，但其物理化學性質非常穩定，會長期存在于地球的生態系統中[3]。在PCBs的209種同系物中，多氯聯苯PCB118是毒性較強的一種。因此，檢測PCB118殘留量是必要的[4]。

目前，檢測多氯聯苯的方法有氣相色譜法、氣相色譜-串聯質譜法、光電化學傳感器法等。其中，藍夢哲[5]建立了魚粉飼料中多氯聯苯殘留量的氣相色譜分析方法，對7種指示性多氯聯苯（PCBs）在3個添加水平的平均回收率（n=5）為83.1%～109.4%，相對標準偏差為0.70%～7.28%。陳麗金[6]建立了測定飼料中多氯聯苯殘留量的氣相色譜析方法，測定結果顯示，18種多氯聯苯的檢出限為0.004～0.010 mg/kg。張桃英等[7]建立了使用快速溶劑萃取（accelerated solvent extraction，ASE）技術提取，毛細管柱為分離柱，以電子捕獲檢測器檢測，用氣相色譜法同時測定果蔬中15種有機氯農藥的殘留量，最低檢出限為1.1～20 μg/kg。王文蘭等[8]建立了一種氣相色譜內標標準曲線法測定魚肉中7種指示性多氯聯苯不確定度的分析方法。時磊等[9]用氣相色譜法測定了稻谷中18種有機氯農藥和7種多氯聯苯的含量。侯圣軍等[10]建立了大米中12種有機氯農藥氣相色譜-電子捕獲檢測器檢測方法。杜靜等[11-14]也應用了氣相色譜法測定多氯聯苯殘留量。何芳等[15]為監測小麥中多氯聯苯污染狀況，應用超聲波提取、分散固相萃取凈化、氣相色譜-質譜法（gas chromatography-massspectrometer，GC-MS）檢測，建立了一種簡單、快速測定小麥中7種指示性多氯聯苯（PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB153、PCB138、PCB180）的分析方法。王定森等[16]研究了Aroclor系列多氯聯苯的組成特點，提出了選取各Aroclor系列多氯聯苯中5～10個特征峰，將選取的特征峰面積加和與濃度制作標準曲線進行定量的方法，作為標準方法的補充說明。楊代鳳等[17]建立了氣相色譜-質譜法同時快速測定小麥中12種二噁英類多氯聯苯（dioxin-like polychlorinated biphenyls，DL-PCBs）的分析方法。朱蕓等[18]建立了加速溶劑萃取-氣相色譜質譜法同時測定34種有機氯農藥（organochlorine pesticides，OCPs）和18種多氯聯苯類化合物（PCBs）的方法。楊梅[19]研究了固相萃取-氣相色譜串級質譜聯用方法測定食品中多氯聯苯的方法。宋梓亮等[20]建立了飼料中多氯聯苯Aroclor 1242系列的氣相色譜-質譜聯用分析方法。潘娟等[21-23]同樣應用了氣相色譜-質譜法對多氯聯苯殘留量進行了測定。王貴珍[24]以單個多氯聯苯的適配體為識別元件，將適配體修飾于不同的納米材料上，構建不同的電化學和光電化學適配體傳感器實現對多氯聯苯（PCBs）單體PCB77和PCB72的測定。

與上述方法相比，免疫化學檢測法對藥物檢測具有快速、特異、靈敏、準確、可以批量監測、樣品處理簡單、能實現自動化操作等優點[25-26]。而免疫化學法檢測多氯聯苯的前提是具備抗多氯聯苯的抗體，本研究制備出一種多氯聯苯單克隆抗體，并應用于膠體金免疫層析試紙條，費用及檢測時限均能夠滿足基層實驗室的檢測需求，該產品已市場化，具有實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多氯聯苯PCB118、PCB52、PCB101、PCB28、PCB138、PCB153、PCB180等標準品（純度≥95%）：北京標準物質研究中心。

1.2 儀器與設備

GT-700膠體金分析儀：北京勤邦生物技術有限公司；HFJ-10均質器、MX-F渦旋儀：湖南湘立科學儀器有限公司；JA2003電子天平：上海力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多氯聯苯半抗原的制備

取多氯聯苯PCB118326mg，加N，N-二甲基甲酰胺20mL溶解，充分攪拌，加入氫氧化鉀0.56 g，加入50%乙醛酸水溶液0.51 mL，加熱至90 ℃，反應8 h，停止反應，加1 mol/L鹽酸，調節pH值至6，加水60 mL，加1,2-二氯乙烷100 mL萃取，靜置分層，分去水相，有機相水洗，干燥，蒸干，上硅膠柱，二氯甲烷/甲醇（10/1，V/V）洗脫分離，得到羧基多氯聯苯PCB118 0.24 g，回收率60%。氯聯苯半抗原合成途徑如下：

1.3.2 免疫原的制備

取羧基多氯聯苯15 mg，加二甲基甲酰胺1 mL溶解，加1-羥基苯并三唑11.4 mg，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺14 mg，室溫反應3 h，得到半抗原溶液A液；取牛血清白蛋白50 mg，加0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液溶解，得到B液，將A液滴加到B液中，4 ℃反應12 h，0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液透析純化3 d，每天換液3次，得到多氯聯苯-牛血清白蛋白偶聯物，即為免疫原，-20 ℃保存，備用。

1.3.3 包被原的制備

取羧基多氯聯苯9 mg，加二甲基亞砜1 mL溶解，加N-羥基琥珀酰亞胺7.9 mg，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺8.4 mg，室溫反應3 h，得到半抗原溶液A液；取卵清蛋白50 mg，后續步驟同1.3.2，得到包被原。

1.3.4 微孔試劑的制備

取0.01%氯金酸水溶液100 mL加熱至沸騰；一邊攪拌，一邊準確加入1%檸檬酸三鈉溶液1.5 mL；待氯金酸水溶液變為酒紅色，繼續煮沸15 min，冷卻后，4 ℃避光保存。在磁力攪拌作用下，用0.2 mol/L Na2CO3溶液調節膠體金溶液的pH值至7.2，加入60 μg多氯聯苯單克隆抗體/mL膠體金溶液，混勻，靜置10 min，加入10%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA），使其在膠體金溶液中的體積分數為1%，靜置10 min。離心、洗滌、重懸，4 ℃保存備用。

試紙條的檢測線T線包被有1.3.3制備的包被原，包被量為1.0 μg/cm2；質控線C線包被有羊抗鼠抗抗體，包被量為1.0 μg/cm2。

將100 μL多氯聯苯單克隆抗體-膠體金標記物加入微孔板中，置于冷凍干燥機，冷阱溫度為-50 ℃，預凍3 h，再真空干燥15 h，得到微孔試劑。

1.3.5 樣本前處理方法

用均質器均質飼料樣本；稱取（5.0±0.05）g均質后的飼料樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入25 mL體積分數50%甲醇，用振蕩器劇烈振蕩5 min，室溫條件下3 000×g離心5min；移取500μL上清液至2 mL聚苯乙烯離心管中，加入500 μL10%氯化鈉水溶液，用振蕩器振蕩1 min，混勻；待用。

1.3.6 檢測方法

向微孔中加入100 mL待測樣本，孵育3 min，吸取70 mL滴至試紙條上，反應10 min，判讀檢測結果，見圖1。

圖1 多氯聯苯膠體金試紙條結果判定示意圖Fig.1 Schematic diagram of polychlorinated biphenyl test strip result determination

1.3.7 試紙條檢測限的測定

在空白飼料樣本（豆粕、牛濃縮飼料、豬濃縮飼料、豬配合飼料、雞配合飼料、魚飼料、玉米胚芽餅）中分別添加多氯聯苯標準品，質量濃度為0、6 μg/L、8 μg/L、10 μg/L、12 μg/L、14 μg/L，按照1.3.6檢測三批試紙條，每個濃度重復5次，根據實驗結果確定樣本檢測限[25-26]。

1.3.8 試紙條特異性的測定

分別配制100 μg/L的PCB52、PCB101、PCB28、PCB138、PCB153、PCB180等藥物，用試紙條重復檢測3次，檢測試紙條的特異性。

1.3.9 試紙條準確性的測定

試紙條的準確性通常以假陽性率和假陰性率表示，假陽性率應小于5%，假陰性率應為0。用試紙條檢測樣品中是否殘留多氯聯苯，通過儀器確證的50份陰性飼料樣品（質量濃度＜10 μg/kg）和50份陽性飼料樣品（質量濃度＞10 μg/kg），計算假陽性率和假陰性率。

1.3.10 試紙條穩定性的測定

用試紙條檢測20份陰性飼料樣品（質量濃度＜10μg/kg）和20份陽性飼料樣品（質量濃度＞10 μg/kg），上述樣品均經過儀器確證，試紙條于2～8 ℃冷藏保存，保存時間分別為1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月，每個樣品重復測定2次，判定試紙條的穩定性。

2 結果與分析

2.1 樣本檢測限

分別配制多氯聯苯質量濃度為0、6μg/L、8μg/L、10μg/L、12 μg/L、14 μg/L的豆粕、牛濃縮飼料、豬濃縮飼料、豬配合飼料、雞配合飼料、魚飼料、玉米胚芽餅等飼料樣品，按照

1.3.6 步驟進行檢測，確定檢測限[25-26]，試驗結果見表1。結果表明，當飼料樣品中多氯聯苯質量濃度為0、6 μg/L、8 μg/L時，試紙條顯示陰性，即未能檢測到樣品中含有多氯聯苯；當飼料樣品中多氯聯苯質量濃度≥10 μg/L時，試紙條顯示陽性，即能夠檢測到樣品中含有多氯聯苯，則該試紙條的檢測限定為10 μg/kg。

表1 多氯聯苯快速檢測試紙條的檢測限Table 1 Detection limit of the polychlorinated biphenyl test strip for rapid detection

2.2 特異性測定結果

該試紙條檢測100 μg/L 的PCB52、PCB101、PCB28、PCB138、PCB153、PCB180等藥物的特異性測定結果見表2。結果表明，檢測結果均呈陰性，即該試紙條與上述藥物無交叉反應，特異性較好。

表2 特異性測定結果Table 2 Result of specificity tests

2.3 準確性測定結果

用試紙條檢測50份陰性和50份陽性豆粕、牛濃縮飼料、豬濃縮飼料、豬配合飼料、雞配合飼料、魚飼料、玉米胚芽餅等飼料樣品，檢測結果見表3。結果表明，未出現假陽性和假陰性，即試紙條準確性較高。

表3 準確性測定結果Table 3 Result of accuracy tests

續表

2.4 穩定性測定結果

針對豆粕、牛濃縮飼料、豬濃縮飼料、豬配合飼料、雞配合飼料、魚飼料、玉米胚芽餅等飼料樣本，試紙條進行了假陽性率和假陰性率的測試，結果見表4。

表4 穩定性測定結果Table 4 Result of stability tests

結果表明，12個月內，穩定性指標均符合要求，說明穩定性能夠維持12個月。從第13個月起，試紙條會出現少量失效、假陽性等現象，即超過12個月，試紙條質量已不穩定。

3 結論

本研究制備出多氯聯苯半抗原，使之與牛血清白蛋白/卵清蛋白偶聯，分別得到多氯聯苯免疫原和多氯聯苯包被原，從而制備出多氯聯苯膠體金免疫層析試紙條。測定了多氯聯苯膠體金試紙條的產品檢測限，并對其特異性、準確性和穩定性等指標進行了測試，均符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求。另外，多氯聯苯膠體金試紙條的檢測限為10 μg/kg，檢測時間僅為15 min，靈敏度高且用時短，即具有免疫快速檢測產品的特點。