益生菌發酵小米漿的工藝優化

馬建功，侯怡帆，王美萍，馬 玲，王曉聞

（山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030800）

小米營養成分豐富，有悠久的食用歷史。許多地方都有將小米粥自然發酵后飲用的習慣，但傳統的方法依靠自然發酵，發酵過程不好控制，最終產品的風味也不好，因而利用選育的乳酸菌結合現代加工工藝技術進行益生菌發酵，不僅可以實現定向發酵，而且可顯著提高小米淀粉及蛋白質的消化率，提高營養價值，改善口感及風味，使發酵過程容易控制，有利于實現工業化生產[1-3]。

國內外有關小米發酵的研究報道較多，KOUAKOU B等[4]研究發現，小米發酵1～2 d時還原糖的含量顯著增加，而蛋白含量降低。SONGRé-OUATTARA L T等[5]從傳統的ben-saalga中篩選的兩株植物乳桿菌A6.1及A6發酵小米花生混合粥，發現植物乳桿菌A6比A6.1的水解及酸化作用更顯著，且植物乳桿菌A6.1發酵后小米花生混合粥中有大量的麥芽三糖和四糖。姚世聰等[6]報道小米經過米曲霉和米根霉3.2751發酵后的總酸、還原糖以及氨基酸態氮含量顯著提高。秦慧彬等[7]研究發現，單一乳酸菌在1%接菌量下發酵48 h后得到的酸粥風味最佳，自由氨基酸含量達到177.23 μg/mL。張麗萍等[8]得出富含L-乳酸小米發酵飲料的最佳工藝參數為發酵溫度36.6 ℃，發酵劑接種量3.15%，氮源添加量2.86%，發酵時間7.76 h。王丹丹[9]研究發現，從傳統酸粥中分離得到的乳酸菌和酵母菌（3∶1）按照10%接種量在34 ℃進行24 h發酵后的小米飲料風味最好。張桂芳等[10]研究得到在白砂糖添加量8%，嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌（1∶1∶2）接種量2.5%，38 ℃條件下發酵9 h得到的發酵小米漿感官評分和多酚含量較高。譚海剛等[11]研究發現，小米與玉米粉以1∶5的比例配比后添加神曲0.26%，添加纖維素酶167 U/g，然后發酵1.5 d后的飲品口感較好。靳志強等[12]將濕熱處理后的小米進行發酵，發現賴氨酸、總氨基酸的生物可給性以及抗氧化活性都得到提高。還有相關的研究發酵對小米淀粉結構及物化特性的影響[13-14]，但對熟制小米漿益生菌發酵工藝的研究及特性分析鮮有報道，因而本試驗以熟制小米漿為原料，利用植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌為復合菌種進行發酵，以感官評分和菌落總數為評價指標，采用單因素試驗和正交試驗優化發酵工藝，以期為開發風味獨特、富含營養成分且具有一定功能的發酵小米飲品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米（山西晉谷21）、白砂糖：市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）：山西農業大學食品科學與工程學院畜產品加工實驗室。

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、無水硫酸鎂、硫酸錳、瓊脂、吐溫-80、硫酸銅：天津市大茂化學試劑廠；亞甲基藍、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、苯酚：索萊寶（北京）有限公司；福林酚（分析純）：美國Sigma公司。試驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

CP114電子天平：帝豪斯儀器有限公司；LDZX-50S立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HPP-9272電熱恒溫培養箱：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海躍進醫療器械廠；LC-406立式冷藏陳列柜：江蘇阪神電器股份有限公司；LD5-2B低速離心機：北京雷勃爾醫療器械有限公司；pHSJ-3F pH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵小米漿工藝流程及操作要點

小米→淘洗、浸泡→煮制→磨漿→加糖→殺菌→冷卻→接種→發酵→成品

淘洗、浸泡：用適量水將小米淘洗干凈，為充分溶出小米中的可溶性物質和煮制方便，淘洗后的小米中加入25倍的水，室溫條件下浸泡12 h。

煮制：將浸泡好的小米在95 ℃條件下連續煮制20 min。

加糖、殺菌：為保證產品的安全，磨漿后的小米漿再進行殺菌（90 ℃、5 min），在殺菌過程中加入7%的白砂糖，充分溶解后冷卻至37 ℃。

接種、發酵：為了進行充分的發酵，接入4%（V/V）的復合菌種（植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=1∶1），充分攪拌均勻后在37 ℃條件下發酵24 h。

1.3.2 單因素試驗

在復合菌種接種量4%、發酵時間24 h的條件下，考察不同白砂糖添加量（5%、6%、7%、8%、9%）對發酵小米漿活菌數和感官評分的影響；在發酵時間24 h、白砂糖添加量7%的條件下，考察不同復合菌種（1∶1）接種量（2%、3%、4%、5%、6%）對發酵小米漿活菌數和感官評分的影響；在復合菌種接種量4%、白砂糖添加量7%的條件下，考察不同發酵時間（8 h、16 h、24 h、32 h、40 h）對發酵小米漿活菌數和感官評分的影響。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，設計3因素3水平正交試驗考察各因素對發酵小米漿活菌數和感官評分的影響，正交試驗因素與水平見表1。

表1 小米漿發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for millet pulp fermentation condition optimization

1.3.4 測定方法

感官評價：取一定量的樣品于燒杯中，由10名具有一定專業知識且經過培訓的感官評定小組成員依照感官評分標準對其色澤、滋味及氣味、狀態進行打分。感官評分標準見表2[9-11]。

表2 發酵小米漿的感官評分標準Table 2 Standards of sensory evaluation of fermented millet pulp

菌落總數：采用稀釋平板法[7]，取1 mL樣品加入9 mL滅菌生理鹽水，依次進行梯度稀釋，取合適稀釋度的樣液1 mL倒入培養皿中，再加入MRS培養基，37 ℃培養48 h后進行菌落計數；

pH值：參考姚世聰等[6]的方法，取一定量的樣品用pH計直接測定；

還原糖：采用菲林試劑法[15]，取樣品1.0 mL定容至25 mL容量瓶中，加入2.5 mL DNS試劑，充分混勻后沸水浴加熱5 min，流水冷卻，以去離子水為空白，分光光度計于波長540 nm處測定吸光度值，根據標準曲線計算還原糖的含量。

總酚：采用Folin-Ciocalteu法[12]。取1 mL樣品，加入30 mL去離子水和2.5 mL福林酚試劑，充分混合均勻后避光放置6 min，再加入7.5 mL 20%碳酸鈉溶液，定容至50 mL。避光室溫條件下靜置2h，分光光度計于波長760nm處測定吸光度值。

礦物質釋放率：參照XIA Q等[16]的方法。取一定量的樣品，加入6 mL 體積分數65%的硝酸、2 mL 體積分數30%的過氧化氫在130 ℃條件下消解4 h。過濾取濾液，用去離子水定容至10 mL后用電感耦合等離子體光譜儀測定鈣、鐵、鋅等礦物質的含量，并通過發酵后的游離礦物質含量和總礦物質含量的比值計算礦物質釋放率。

氨基酸態氮：三氯乙酸沉淀法[17]，取一定量的樣品加入20%三氯乙酸溶液，混勻后靜置60 min，4 000 r/min離心10 min，凱氏定氮儀測定上清液中的總氮含量。

2 結果與分析

2.1 白砂糖添加量對小米漿發酵的影響

由圖1可知，不同的白砂糖添加量對小米漿發酵后的感官評分和菌落總數影響較小，在添加量為5%時，發酵完成后小米漿菌落總數和感官評分較低，此后隨著白砂糖添加量的增加，感官評分和菌落總數不斷增加，當白砂糖添加量為7%時，發酵小米漿感官評分達最高值81.44分，菌落總數也達到最高值8.23 lg（CFU/mL）。與張桂芳等[10]報道的在糊化酶解后的小米漿加入8%的白砂糖經過嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌菌（1∶1∶2）發酵后的感官評分較高的結果接近，與楊健等[18-19]報道的結果一致。復合菌種發酵中白砂糖主要影響發酵后小米飲料甜度和口感，當加入量較低時甜度不夠，而加糖量較高時甜度太大，而復合菌種發酵過程中優先利用小米漿中的低聚糖、還原糖產酸，在本試驗的濃度范圍內，白砂糖對發酵后乳酸菌的數量影響較小。因此，確定白砂糖添加量以7%為宜。

圖1 白砂糖添加量對發酵小米漿菌落總數和感官評分的影響Fig.1 Effect of sugar addition on total bacterial count and sensory score of fermented millet pulp

2.2 接種量對小米漿發酵的影響

由圖2可知，不同的接種量對小米漿發酵后的感官評分和菌落總數有一定影響，復合菌種接種量低時，發酵時間延長且發酵不充分，發酵完成后菌落總數較低，代謝產生的酸也較少，致使發酵后的小米漿感官評分較低，隨著復合菌種接種量的增加，感官評分和菌落總數都不斷增加，當接種量達到4%時，發酵完成后菌落數上升不明顯，而感官評分在接菌量為4%時也不再有明顯變化，此時發酵小米漿感官評分和菌落總數分別為83.20 lg（CFU/mL）和8.30 lg（CFU/mL）。這一結果與宋忠勵[20]研究得出的植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌分別發酵小米飲料時最適接種量的結果一致，而與辛泓均[21]研究得到的嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和副干酪乳桿菌（1∶1∶1）發酵小米飲料最適接種量2%的結果不同，與趙修報等[22]研究得出的酵母菌、乳酸菌共同發酵糊化、糖化的大麥芽、小米、赤小豆、燕麥谷物飲料時2.5%的最適接種量也不同，可能與前體原料處理不同以及所用復合菌種不同有關。因此，確定復合菌種接種量以4%為宜。

圖2 復合菌種接種量對發酵小米漿菌落總數和感官評分的影響Fig.2 Effect of compound strains inoculum on total bacterial count and sensory score of fermented millet pulp

2.3 發酵時間對小米漿發酵的影響

由圖3可知，不同的發酵時間對小米漿發酵后的感官評分和菌落總數影響較大，發酵時間太短，發酵不完全，產酸量也不夠，致使發酵小米漿菌落總數和感官評分都較低，而延長發酵時間后菌落數和感官評分都不斷增加，但在發酵24 h后發酵小米漿菌落總數達到8.45 lg（CFU/mL）且不再隨著發酵時間的延長而明顯增加，感官評分也在發酵32 h后下降，可能因為小米漿中可利用的低聚糖、還原糖等底物在24 h發酵后大大降低，加上菌體代謝產生的酸等物質對自身的抑制，因而再延長發酵時間菌落數不再明顯增加。而感官評分在發酵32 h時達到最高值86.46分，可能因為盡管乳酸菌在24 h后增長不明顯，但其自身代謝產生的酶可以促進部分生化反應，進而生成對風味有益的物質。與宋忠勵等[20-21]研究得出的結果一致，而與張桂芳等[10，18，23]的結果不一致，可能與選取的發酵菌種不同有關。為降低長時間發酵過程中污染的風險，綜合感官評分和菌落數的結果，選擇發酵時間為24 h為宜。

圖3 發酵時間對發酵小米漿菌落總數和感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total bacterial count and sensory score of fermented millet pulp

2.4 正交試驗

以發酵后的菌落總數作為參照指標，作為活菌型的發酵制品，期望發酵后的活菌數越高越好，通過對正交試驗結果分析可知，對菌落總數變化的影響因素順序為C＞B＞A，即發酵時間＞接種量＞加糖量。可知3種影響因素中對活菌數影響最大的是發酵時間，其次是接種量，影響最小的是加糖量。而以感官評分作為評價指標，各因素對感官評分的影響順序為C＞B＞A，即發酵時間＞接種量＞加糖量。

表3 小米漿發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for millet pulp fermentation condition optimization

9個試驗處理中菌落總數最高8.98 lg（CFU/mL）的水平組合為A2B3C3，對應的感官評分為82.12分，而9個試驗處理中感官評分最高（87.81分）的水平組合為A1B2C3，對應的菌落總數為8.79 lg（CFU/mL）。二者不一致，但作為發酵飲品，優先考慮感官評分，同時感官評分最高組合A1B2C3對應菌落總數8.79 lg（CFU/mL）和最高菌落總數8.98 lg（CFU/mL）接近，因而綜合確定最優的組合為A1B2C3，即白砂糖添加量6.5%、接種量4.0%、發酵時間28 h。

2.5 發酵小米漿的理化指標

為進一步分析發酵后小米漿的理化指標，對發酵前后的小米漿pH值、還原糖含量、總酚含量、礦物質釋放率以及氨基酸態氮含量進行比較，結果見表4。

表4 發酵小米漿的部分理化指標Table 4 Some physicochemical indexes of fermented millet pulp

由表4可知，發酵后小米漿的pH由6.51降低至4.58，而同時淀粉被糊化后經益生菌代謝生成了更多的還原糖，達到0.66 mg/100 g，經過發酵后總酚含量由0.13增加至0.75 μg/mL，可能因為小米中的大部分酚類與蛋白質、淀粉等生物大分子結合變得不可溶，發酵過程中微生物產生的水解酶作用于蛋白質和淀粉，從而釋放了復合物中的酚類，與靳志強等[12，24]的研究結果相似。礦物質釋放率經過發酵后也大大提高，可能因為植酸、酚類化合物等礦物質螯合劑影響礦物質的釋放，發酵過程中微生物產生的植酸酶將植酸降解，從而可提高礦物質的釋放率[25]。發酵可以降低抗營養因子含量，同時發酵過程中產生的豐富酶系可以將原料中的蛋白質分解成游離的氨基酸，從而增加蛋白質的消化率，同時部分氨基酸也會增加產品的風味，小米漿經過發酵后的氨基酸態氮大大提高，達到25.76 mg/100 g，說明發酵可以促進小米漿中的蛋白降解，進而提高其營養價值。

3 結論

以發酵小米漿感官評分和菌落總數為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗設計優化了益生菌發酵小米漿的工藝參數，優化后的發酵工藝參數為白砂糖添加量6.5%、接菌量4.0%、37℃條件下發酵28h。在此工藝下發酵后的小米漿具有較高的感官評分和活菌數，同時還原糖含量、總酚含量、礦物質釋放率和氨基酸態氮分別由原來的0.28g/100g、0.13 μg/mL、1.28%、6.32 mg/100 g提高至0.66 g/100 g、0.75 μg/mL、5.43%、25.76 mg/100 g。