基于高通量測序解析賒店老酒濃香型白酒大曲古菌群落多樣性

劉延波，李海登，秦夢星，趙志軍，王 賢，韓素娜，潘春梅

（1.河南牧業(yè)經濟學院 食品與生物工程學院（酒業(yè)學院），河南 鄭州 450046；2.河南仰韶酒業(yè)有限公司 博士后科研工作站，河南 三門峽 472400；3.河南牧業(yè)經濟學院河南省白酒風格工程技術研究中心，河南 鄭州 450046；4.河南牧業(yè)經濟學院鄭州市白酒釀造微生物技術重點實驗室，河南 鄭州 450046；5.賒店老酒股份有限公司，河南 南陽 473300）

大曲是白酒釀造過程中的重要物質，在白酒釀造過程中起著糖化、發(fā)酵、生香的作用[1]。大曲在制作上采用自然接種和開放式發(fā)酵[2]，富集制曲環(huán)境中的各種微生物在曲坯中生長，包括細菌、真菌和古菌，它們在曲坯中彼消此長，最終形成獨特的群落結構[3]。古菌相較于細菌和真菌在大曲中占比較少，但在濃香型白酒的產香過程中起著重要作用，不僅促進己酸發(fā)酵進程多產己酸，而且能增加己酸乙酯含量以及有效的降低甲醇的含量，提高酒質[4]。因此，研究大曲中古菌群落結構具有重要意義。

近幾年，隨著第二代測序技術的迅猛發(fā)展，高通量測序技術被廣泛應用于釀酒微生物多樣性研究[5]，其相比于傳統微生物分離、熒光原位雜交、末端限制性片段長度多態(tài)性分析和變性梯度凝膠電泳等方法具有準確定量、靈敏度高、工作量小、耗費少等優(yōu)點[6-8]。

目前，在白酒釀造方面，對于古菌的研究多見于窖泥[9-12]、酒醅[13]、發(fā)酵黃水[14]，但對大曲的研究較少，并且利用高通量測序技術解析濃香型白酒大曲古菌群落多樣性的研究鮮見報道。因此，本研究采用高通量測序技術對賒店老酒濃香型白酒大曲的古菌群落多樣性進行分析，并進行蛋白直系同源簇（clusters of orthologous groups，COG）功能預測分析，為探究中原地區(qū)大曲的制作以及白酒創(chuàng)新發(fā)展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型白酒大曲樣品B1：河南賒店老酒酒業(yè)有限公司。對稱取樣后，經破碎、過篩（20目）、混勻、縮分，于-20 ℃冰箱存放。

1.1.2 試劑

1.2 儀器與設備

Pico-21式離心機：美國Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳拓能達科技有限公司；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽：北京市六一儀器廠；凝膠成像系統：美國UVP公司；熒光計：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；T100TM Thermal Cyeler 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國BIO-RAD公司。

1.3 大曲基因組的提取

1.3.1 樣品預處理

稱取大曲樣品200 mg于滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL體積分數為70%的乙醇，振蕩混勻，10 000 r/min室溫離心3 min，棄上清液。加入1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶液，振蕩混勻，10 000 r/min室溫離心3 min，棄上清液。倒置2 mL管于吸水紙上1 min，直至沒有液體流出。將樣品管放入55 ℃烘箱10 min，使殘留酒精完全揮發(fā)[15]。

1.3.2 DNA的提取

1.3.3 PCR擴增

第一輪擴增：利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量。以基因組DNA為模板，采用引物1st-340F（5'-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3'）、1st-1000R（5'-GGCCATGCACYWCYTCTC-3'）進行PCR擴增。PCR擴僧體系：2×Taqmaster Mix 5 μL、引物1st-340F（10 μmol/L）1 μL、引物1st-1000R（10 μmol/L）1 μL、基因組DNA 20 ng、雙蒸水（ddH2O）補充至30 μL。PCR擴增程序：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，45 ℃、20 s，65 ℃、30 s（進行5個循環(huán)）；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s（進行20個循環(huán)）；72 ℃、5 min；10 ℃保存。

第二輪擴增：以第一輪PCR擴增產物為模板，采用V3-V4通用引物349F（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）GYGCASCAGKCGMGAAW-3'）、806R（5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGGTATCTAAT-3'）對第一輪擴增產物進行PCR擴增。PCR擴增體系：2×Taqmaster Mix 5 μL；349F（10 μmol/L）1 μL、806R（10 μmol/L）1 μL、第一輪PCR擴增產物20 ng、ddH2O補充至30 μL。PCR擴增程序：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，45 ℃、20 s，65 ℃、30 s（5個循環(huán)）；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s（20個循環(huán)）；72 ℃、5 min；10 ℃保存。

第三輪擴增：引入Illumina橋式PCR兼容引物。PCR擴增體系：2×Taqmaster Mix 5 μL、Bar-PCR primer F（10 μmol/L）1 μL；primer R（10 μmol/L）1 μL、第二輪PCR擴增產物20 ng、ddH2O水補充至30 μL。PCR擴增程序：95 ℃、3 min；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s（5個循環(huán)）；72 ℃、5 min；10 ℃保存。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后，純化回收DNA，利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，按照1∶1等量混合后委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.4 測序及數據分析

應用Miseq 2×300 bp測序平臺進行測定，并且通過測序數據統計分析、操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）分析、Alpha多樣性分析、物種分類學分析和COG功能預測分析等不同方面對大曲的古菌菌落多樣性進行分析。

2 結果與分析

2.1 古菌16S rDNA V3-V4區(qū)基因的PCR擴增

古菌16S rDNA V3-V4區(qū)基因的PCR擴增結果見圖1。由圖1可知，PCR擴增產物堿基長度為500 bp左右，與目標相符，純化回收后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

圖1 古菌16S rDNA V3-V4區(qū)基因的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplified products from archaea 16S rDNA V3-V4 region

2.2 測序數據結果分析

對古菌16S rDNA V3-V4區(qū)基因序列進行高通量測序，通過barcode標簽序列（5'-GCGTGTG-3'）得到樣本的數據，為了提高后續(xù)分析質量和可靠性，對原始序列進行去接頭、質量控制（quality control，QC）等處理，結果見表1。由表1可知，大曲樣品B1中檢測到的原始reads數目為77 563個，平均堿基長度為417.01 bp。通過質控去除barcode、兩端引物及部分低質量序列，得到74 434條基因序列，平均堿基長度為379.26 bp；PCR擴增后，產生887個嵌合體；非靶區(qū)域序列數目有531個；為保證測序數據信息的分析質量，再通過去除嵌合體與靶區(qū)域外序列發(fā)現，大曲樣品B1中有73 000條基因序列。

表1 大曲樣品B1中古菌16S rDNA V3-V4區(qū)基因序列測序結果Table 1 Sequencing results of 16S rDNA V3-V4 region gene sequence of archaea in Daqu samples B1

2.3 Alpha多樣性分析

Shannon指數、Chao1指數、Simpson指數和Coverage等Alpha多樣性指數常用于衡量微生物群落多樣性[16]，大曲樣品B1中古菌的Alpha多樣性分析結果見表2。由表2可知，大曲樣品B1的Coverage值為1，證明實驗取樣合理，測序結果能反映樣本的真實情況，其中可注釋的OTU數為417個，Shannon指數、Chao1指數、Simpson指數分別為2.05、474.13、0.34。

表2 大曲樣品B1中古菌的Alpha多樣性分析結果Table 2 Results of Alpha diversity analysis of archaea in Daqu sample B1

2.4 Shannon指數曲線分析

使用相似度＞97%的OTU，利用mothur進行rarefaction分析，利用R制作曲線圖，結果見圖2。由圖2可知，隨著測序數量的增加，曲線趨于平坦，更多的數據量只會產生少量新的OTU，證明本次測序數據量合理。

圖2 大曲樣品B1的Shannon指數稀釋曲線Fig.2 Shannon index dilution curve of Daqu sample B1

2.5 物種分類學分析

將得到的所有OTU和數據庫進行比對，對其進行物種分類，獲得各個OTU的分類水平，即門、綱、目、科、屬分類水平。基于門、屬水平大曲樣品B1中古菌的群落結構分別見圖3和圖4。

圖3 基于門水平大曲樣品B1古菌群落結構分析結果Fig.3 Analysis results of archaea community structure in Daqu sample B1 based on phylum level

圖4 基于屬水平上大曲樣品B1古菌群落結構分析結果Fig.4 Analysis results of archaea community structure in Daqu sample B1 based on genus level

由圖3可知，大曲樣品B1中共注釋到6個古菌門，其中優(yōu)勢古菌門（相對豐度＞1%）為廣古菌門（Euryarchaeota）（98.51%），非優(yōu)勢古菌門為泉古菌門（Crenarchaeota）（0.63%）烏斯古菌門（Woesearchaeota）（0.40%）、奇古菌門（Thaumarchaeota）（0.31%）、佩斯古菌門（Pacearchaeota）（0.03%）、Others（0.06%）、未分類菌門（unclassified）（0.02%）。邊名鴻等[17]利用核糖體DNA擴增片段限制性內切酶分析（amplifed ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）免培養(yǎng)手段研究醬香型窖泥中的古菌群落結構，結果表明，醬香型窖泥中古菌主要為廣古菌門；李可[18]采用傳統培養(yǎng)和構建小亞基核糖體（ribosomal small subunit rRNA，SSU rRNA）文庫的方法對中國濃香型白酒發(fā)酵黃水微生物群落結構及多樣性研究發(fā)現主要古菌為廣古菌門；WU C等[19]利用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gel gradient electrophoresis，PCR-DGGE）研究不同窖齡窖泥中的古菌群落，發(fā)現所有古菌的16S rRNA基因序列均歸為廣古菌門；趙東等[20]運用高通量測序技術解析五糧液窖泥原核微生物群落結構發(fā)現，古菌門有廣古菌門、泉古菌門；張應剛等[21]基于高通量測序分析不同窖齡窖泥微生物結構與多樣性，結果表明古菌主要為廣古菌門、奇古菌門和泉古菌門。本實驗研究結果與前人研究結果一致，廣古菌門不僅在窖泥、發(fā)酵黃水中為絕對優(yōu)勢菌門，在大曲中也是絕對優(yōu)勢菌門，說明廣古菌門類古菌在白酒釀造中發(fā)揮著重要作用，對白酒風味的形成至關重要；除廣古菌門、泉古菌門、奇古菌門外，還新發(fā)現烏斯古菌門、佩斯古菌門，這兩個菌門的報道多見于對甲烷鹽堿環(huán)境和海洋沉積物的研究[22-23]。

由圖4可知，大曲樣品B1中共注釋到20個古菌屬，其中優(yōu)勢古菌屬（相對豐度＞1%）為甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）（61.92%）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）（10.51%）、甲烷發(fā)菌屬（Methanothrix）（7.17%）、鹽堿球菌屬（Halalkalicoccus）（6.30%）、Methanomassiliicoccus（3.84%）、甲烷球形菌屬（Methanosphaera）（1.72%）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）（1.61%）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）（1.07%）、Methanospirillum（1.04%）、甲烷嗜熱桿菌屬（Methanothermobacter）（1.00%）、unclassified（2.02%），非優(yōu)勢古菌屬為產甲烷石狀菌屬（Methanocalculus）（0.28%）、WoesearchaeotaIncertae Sedis AR16（0.22%）、亞硝化暖菌屬（Nitrososphaera）（0.20%）、Methanosphaerula（0.17%）、甲烷繩菌屬（Methanolinea）（0.11%）、亞硝化侏儒菌屬（Nitrosopumilus）（0.11%）、Methanoregula（0.07%）、熱球菌屬（Thermococcus）（0.05%）、WoesearchaeotaIncertae Sedis AR15（0.04%）、Others（0.53%）。

葉光斌等[24]基于免培養(yǎng)法發(fā)現窖泥中古菌屬有甲烷囊菌屬、甲烷八疊球菌屬、甲烷桿菌屬和Methanomassiliic-occus；陶勇等[11]通過454焦磷酸測序法在不同窖齡窖泥中發(fā)現古菌的群落有甲烷短桿菌屬、甲烷囊菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷八疊球菌屬；王明躍等[25]應用PCR-ARDRA和16S rRNA基因克隆測序技術針對窖泥古菌群落研究發(fā)現，古菌的群落組成是甲烷囊菌屬、甲烷八疊球菌屬、甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）和甲烷桿菌屬；WANG X等[26]通過對窖泥和酒醅進行高通量測序發(fā)現甲烷桿菌屬和甲烷短桿菌屬占主導地位。本研究得益于先進的高通量測序技術，在大曲優(yōu)勢菌屬數量上較上述研究發(fā)現的要多。

大曲中的菌群主要為甲烷菌，其對窖泥的老熟有促進作用[27]；甲烷短桿菌屬、甲烷囊菌屬和甲烷桿菌屬等為氫營養(yǎng)型產甲烷菌，它們能夠消耗己酸和乙酸代謝的H2和CO2，解除己酸菌代謝的反饋抑制作用，增強與己酸菌的“種間氫轉移關系”，在濃香型白酒生產中促進己酸發(fā)酵進程多產己酸，從而增加己酸乙酯含量以提高酒質[28]；由于產生低沸點的甲烷氣體，不僅能夠帶走大量熱量，抑制雜菌繁殖，而且能使發(fā)酵按照理想的溫度緩慢進行，提高發(fā)酵效率，增加產量[29]。

此外本研究首次在釀酒領域的研究中發(fā)現鹽堿球菌屬（Halalkalicoccus）、熱球菌屬（Thermococcus）、甲烷繩菌屬（Methanolinea）、亞硝化侏儒菌屬（Nitrosopumilus），這極大的豐富了釀酒微生物信息資源庫。鹽堿球菌屬類古菌多存在于高鹽等極端環(huán)境[30]，這類古菌類群可以分泌蛋白酶降解環(huán)境中的蛋白質，形成小分子的肽和氨基酸[31]，因此推測該菌屬類古菌對濃香型白酒香氣成分有一定的貢獻；熱球菌屬是一類產環(huán)糊精酶的嗜熱古菌，可以通過H2發(fā)酵在丙酮酸或麥芽低聚糖上生長，多用于麥芽七糖的制備[32-33]；甲烷繩菌屬是一種生活于厭氧消化污泥、沼澤中的產甲烷古菌[34-35]；亞硝化侏儒菌屬屬于氨氧化古細菌，具有一定的硝化能力[36]。目前對于大曲中古菌的研究仍然滯后，這些菌屬在整個釀造過程中是否普遍分布、在白酒發(fā)酵過程中發(fā)揮什么樣的作用以及具體的影響等都有待研究。

2.6 COG功能預測分析

為了得知大曲樣品B1更高層級水平上的功能情況，通過對已有測序微生物基因組的基因功能的構成進行分析后，通過16S rRNA測序獲得的物種構成推測樣本中的功能基因的構成，結果見表3。由表3可知，預測大曲樣品B1古菌群落的COG功能有4類，分別為新陳代謝類（8個）、細胞過程和信號傳導類（10個）、信息存儲與處理類（5個）和特征差的功能（2個）。過濾掉特征差的功能，大曲樣品B1古菌群落的COG功能富集豐度前6的功能有翻譯、核糖體結構和生物發(fā)生，能源生產與轉化，氨基酸轉運和代謝，輔酶運輸和代謝，復制、重組和修復和轉錄，反映了大曲中各種酶系的合成活躍。

表3 大曲樣品B1中古菌群落的蛋白COG功能分類結果Table 3 Results of protein COG function classification of archaea community in Daqu sample B1

3 結論

本研究運用高通量測序技術分析賒店老酒大曲的古菌群落多樣性及功能情況。結果表明，大曲的優(yōu)勢古菌門為廣古菌門（Euryarchaeota），優(yōu)勢古菌屬有甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、甲烷發(fā)菌屬（Methanothrix）、鹽堿球菌屬（Halalkalicoccus）、Methanomassiliicoccus、甲烷球形菌屬（Methanosphaera）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、Methanospirillum、甲烷嗜熱桿菌屬（Methanothermobacter）。此外，首次在大曲中發(fā)現鹽堿球菌屬（Halalkalicoccus）、熱球菌屬（Thermococcus）、甲烷繩菌屬（Methanolinea）、亞硝化侏儒菌屬（Nitrosopumilus），COG功能主要富集在翻譯、核糖體結構和生物發(fā)生，能源生產與轉化，氨基酸轉運和代謝，輔酶運輸和代謝，復制、重組和修復，轉錄，反映了大曲中各種酶系的合成活躍。本研究結果極大豐富了濃香型白酒大曲中古菌的數據資源，對中原地區(qū)的大曲的制作以及白酒的創(chuàng)新性發(fā)展具有重要意義，為下一步分離純種進行發(fā)酵產香實驗奠定基礎。