不同酵母對威士忌品質的影響

宋緒磊，沈國全，路 峻，汪逸然，楊貽功，董建輝，姜 欣

（1.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；2.蓬萊市葡萄與葡萄酒產業發展服務中心，山東 蓬萊 265600；3.蓬萊市鈺之錦蒸餾酒研究所，山東 蓬萊 265609）

威士忌是一種由大麥等谷物釀制，在橡木桶中陳釀多年后，調配成43度左右的烈性蒸餾酒[1-2]。威士忌作為英國的國酒，是與中國白酒、白蘭地、伏特加、朗姆酒和金酒齊名的世界最著名的六大優質蒸餾酒[3]。威士忌在國際酒類貿易中占重要地位[4]，從進口的貿易金額來看，1997年～2017年英國是第一大進口市場，其貿易金額市場占比約為66.5%～93.7%；從出口貿易金額可以看出，近年來我國威士忌出口貿易金額呈增長趨勢[5]。

發展特色的中國威士忌離不開特色的威士忌酵母，優良的威士忌酵母除了具有降糖速度快[6]、發酵周期短[7-8]、酒精產量高[9]和產出優質風味物質[10]等特點之外，還要在風味特征方面具有特色。2020年，WANIKAWA A[11]對使用啤酒酵母發酵威士忌的研究進展進行了綜述，其中提到啤酒酵母產生的風味化合物會直接影響到威士忌酒的品質。REID S J等[12]研究了在發酵初期進行細菌發酵的效果，結果表明利用乳桿菌進行預處理可以改變酒的品質。2016年，孟金明[13]通混菌發酵提高了大麥酒的品質，采用順序接種釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和漢遜酵母（Hansenula polymorpha），所得酒樣醇酯比達到1∶1，酒的品質有明顯的提高。在風味物質檢測方面，2019年，JELEN′ H H等[14]采用氣相色譜-嗅覺儀對單一麥芽威士忌的主要風味物質進行了鑒定，其研究結果可用于通過揮發性成分區分單一麥芽威士忌、單一麥芽泥煤威士忌、谷物威士忌和美國威士忌。2014年，BENDIG P等[15]用氣相色譜-電子捕獲負離子質譜測定了兩種蘇格蘭單一麥芽威士忌中的溴酚，開發了一種適用于測定威士忌中二溴和三溴苯酚的方法。

本研究以大麥芽為原料，選用3種不同酵母（酵母ACBC-1、ACBC-2、ACBC-3）制備威士忌，對比酵母發酵性能、理化指標及出酒率，氣相色譜（gas chromatography，GC）法測定酒樣的風味物質，通過氣味活度值（odor activity value，OAV）確定關鍵香氣化合物及主成分分析（principal component analysis，PCA），并對其進行感官評價，考察不同酵母對威士忌品質的影響，通過初步研究為優良、特色威士忌酵母菌株的選育及應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

大麥芽：克里斯普英國進口麥芽。

威士忌專用酵母ACBC-1、ACBC-2、ACBC-3：中國食品發酵工業研究院應用微生物菌種中心。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉（分析純）：北京化工廠有限責任公司；甲醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、活性戊醇、正己醇、乙醛、異丁醛、乙縮醛、丙醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇、乙酸苯乙酯、糠醛、丙酮、3-羥基-2-丁酮（均為分析純）：比利時ACROS 公司。

1.2 儀器與設備

50 L啤酒釀造設備：青島優易釀自動化設備技術有限公司；6394麥芽粉碎機：德國KüNZEL公司；20 L多功能蒸餾器、2.5 L多功能蒸餾器：煙臺吉訊釀酒設備廠；CLARUS 600氣相色譜儀：珀金埃爾默儀器有限公司；PHS-2F型pH計：上海雷磁儀器有限公司；0-40度、40-70度、70-100度酒精計：武強縣新林儀器儀表有限公司；0-10度、10-20度糖度計：衡水華普儀器儀表有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 威士忌的加工工藝流程及操作要點

原料→粉碎→糖化→發酵→蒸餾→橡木桶存放→調配→威士忌

操作要點：

麥汁的糖化：以制作15°P麥汁50 L為目標，根據麥芽的出糖率以及設備的轉化率，計算得麥芽的使用量為11.5 kg，麥芽的粉碎度為1.5 mm，加水的體積為35 L，在糖化過程中于45 ℃保溫30 min，64 ℃保溫60 min，70 ℃保溫20 min[16]，通過碘檢驗作為觀察糖化結束的方法，若滴加碘液后不變色則糖化完全，變藍則糖化不完全。

發酵：將麥汁升溫到80 ℃后移入發酵罐，入罐溫度控制在（30±2）℃，40 g酵母粉先用400 mL水活化30 min后倒入麥汁中，發酵溫度設置為28～32 ℃，發酵72 h，每8 h測定一次糖度，若連續兩次糖度不變即得發酵液。每種酵母做3次平行實驗。

發酵液的蒸餾：使用20 L多功能蒸餾器對發酵液過蒸餾塔蒸餾，蒸餾溫度控制在（92±2）℃，收集蒸餾出的酒液，每隔10 min用酒精計測定一次蒸餾出酒液的酒精度，酒液酒精度降至5%vol停止收集。然后使用2.5 L多功能蒸餾器對過塔蒸餾出的酒液進行二次蒸餾，蒸餾溫度控制在（82±2）℃，蒸餾時每收集50 mL酒液用酒精計測定一次酒液的酒精度，酒精度為76%vol及以上的酒液為酒頭，60%vol～76%vol的酒液為酒身，40%vol～60%vol的酒液為酒尾，40%vol以下的酒液為廢液。

存放：由于橡木桶存放時間較長，存放前風味的差異主要來源于酵母，存放后會減小這種差異[17]，不利于對比酵母對威士忌酒液的影響，因此本研究中僅對比橡木桶存放前的酒液。

調配：取上述蒸餾后的酒身用蒸餾水稀釋至40%vol，得到威士忌。

1.3.2 分析檢測

pH值的測定：采用pH計；糖度的測定：采用糖度計；總酸含量的測定：參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[18]中第一法電位滴定法；酒精度的測定：參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[18]中第一法密度瓶法。

1.3.3 出酒率的計算

麥芽出酒率計算公式如下：

1.3.4 威士忌揮發性香氣物質的檢測

采用氣相色譜法測定二次蒸餾后酒身的揮發性香氣物質含量。準確吸取5 mL酒液樣品于氣相樣品瓶中，上機測定。氣相色譜條件：進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度250 ℃；色譜柱：CP-WAX 57 CB（50 m×0.25 mm×0.2 μm）；載氣為高純氮氣（N2）（純度≥99.999%），流速1 mL/min；分流比20∶1；升溫程序：40 ℃保溫4 min，4 ℃/min升溫到130 ℃，15 ℃/min升溫到210 ℃，保持15 min。

定性定量的方法：根據色譜峰出峰時間與標準品出峰時間對照定性組分，并根據峰面積大小確定物質含量。

氣味活度值（OAV）是酒樣中揮發性香氣物質的含量與其感官閾值的比值，可以客觀的表現出該香氣成分對于酒樣整體風味物質的貢獻程度，OAV＞1的香氣成分對酒樣的香氣有顯著影響，OAV越大說明該香氣物質對酒樣香氣的影響越大[19]，其計算公式如下：

1.3.5 主成分分析

主成分分析是一種通過降維將多個變量變為少數綜合變量，用簡化的數據反應原始變量的大部分信息的統計方法[20]。利用主成分分析法對酒樣的香氣物質的氣味活度值進行分析，可以得出香氣綜合得分較高的酒樣，從而選出可以促進威士忌蒸餾酒產生優質風味的酵母。

1.3.6 感官評價

組成6人感官評價小組（其中男3人、女3人，6人均為國家評委）。感官評價的酒樣為二次蒸餾后的酒身，酒精度為40%vol，每人對酒樣的色澤（20分），香味（30分），滋味（40分）和典型性（10分）進行打分，滿分100分，具體評價標準[21]見表1。

表1 威士忌的感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standards of whisky

1.3.7 數據處理

采用SPSS 26.0對酒樣的理化指標進行單因素方差分析（P＜0.05），對酒樣的揮發性香氣物質進行主成分分析；用Origin 9.0作圖；用Excel 2016對數據進行處理。實驗中理化指標的測定均重復測定3次，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 不同酵母的發酵性能

降糖情況可以反映出酵母的發酵性能，降糖速度快說明酵母的發酵速度快[22]。

由圖1可知，發酵時間在0～24 h時，酵母ACBC-1與酵母ACBC-2的降糖速度較快，酵母ACBC-3的降糖速度較慢；發酵時間在24～48 h時，酵母ACBC-1和酵母ACBC-2的降糖速度明顯下降，酵母ACBC-3的降糖速度較快；發酵時間在48～72 h時，3種酵母的降糖速度趨于穩定。結果表明，發酵結束時（72 h），酵母ACBC-1殘糖量為3.0 g/100 g，酵母ACBC-2殘糖量為4.1 g/100 g，酵母ACBC-3的殘糖量為3.8 g/100 g。在發酵結束時，剩余發酵液的糖度值越低說明酵母發酵能力就越強[23]。因此，酵母ACBC-1發酵性能最強。

圖1 不同酵母的發酵性能曲線Fig.1 Fermentation performance curves of different yeasts

2.2 不同酵母發酵液理化指標測定

pH值是影響酶活和酵母新陳代謝的重要因素，總酸含量對風味有不同的影響。由表2可知，以麥汁作為對照樣，對比3種酵母發酵液的糖度可知，經過發酵后的麥汁糖度明顯下降，其中酵母ACBC-1發酵液糖度為3.00 g/100 g，其發酵能力顯著高于其他兩種酵母（P＜0.05），酵母ACBC-2和酵母ACBC-3的發酵能力無顯著性差異（P＞0.05）。3種酵母發酵液的酒精度在5.24%vol～6.42%vol之間，酵母ACBC-2和酵母ACBC-3的產酒精能力無顯著性差異（P＞0.05）。3種酵母發酵液的pH值在3.66～4.10之間，總酸含量在3.73～4.17 g/L之間，與發酵前的麥汁相比，3種酵母發酵液中總酸含量上升，pH值下降，酵母ACBC-2的發酵液總酸含量（4.17 g/L）顯著高于其他兩種酵母發酵液（P＜0.05），說明酵母ACBC-2的產酸能力較強。因此，從不同酵母發酵液的理化指標來看，酵母ACBC-1最佳。

表2 麥汁及不同酵母發酵液的理化指標測定結果Table 2 Determination results of physical and chemical indexes of wort and fermentation liquid with different yeasts

2.3 不同酵母發酵麥芽對出酒率的影響

由表3可知，酵母ACBC-1的單位麥芽出酒率（70.78 mL/kg）高于其他兩種酵母，表明在使用相同質量原料的情況下，酵母ACBC-1可以生產出更多的酒精。

表3 不同酵母發酵麥芽出酒率Table 3 Liquor yield of malt fermented by different yeasts

2.4 不同酵母發酵對威士忌酒樣揮發性香氣物質的影響

2.4.1 3種酵母制備威士忌酒樣香氣成分分析

由表4可知，3個酒樣中共檢出揮發性香氣物質24種，包括醇類8種，醛類4種，酯類7種，芳香族2種，呋喃類1種，其他類2種。其中醇類化合物含量較高，酵母ACBC-1、ACBC-2、ACBC-3發酵制備威士忌蒸餾酒中的醇類化合物含量分別為4 026.57 mg/L、3 124.88 mg/L、4 458.67 mg/L。酒樣ACBC-3的異戊醇含量最高（2 426.67 mg/L），可以為酒體提供水果香和花香，酒樣ACBC-1的正丙醇含量最高（533.05 mg/L），可以為酒體提供花香和青草香。酒樣ACBC-1酯類化合物的含量（148.60 mg/L）和芳香族化合物的含量（164.45 mg/L）明顯高于其他兩個酒樣。

表4 3種酵母制備威士忌中揮發性香氣物質含量測定結果Table 4 Determination results of volatile aroma compounds contents in whisky produced by 3 kinds of yeasts

續表

2.4.2 揮發性香氣物質氣味活度值分析

酒液中的揮發性香氣成分含量和對酒體香氣的貢獻不一定成正比，還要綜合香氣物質的香氣特征和感官閾值來判斷。

由表5可知，3個酒樣共檢出了9種OAV＞1的香氣物質，醇類物質的OAV＞1的香氣物質有4種，酯類物質的OAV＞1的香氣物質種類最多（5種），說明酯類物質對酒樣香氣作用顯著。酒樣ACBC-1乙酸苯乙酯的OAV最高（103.92），給酒液帶來玫瑰香和草莓香，酒樣ACBC-2中OAV較大的物質是乙酸異戊酯（OAV為44.98），酒液具有香蕉香，酒樣ACBC-3中OAV較高的物質是乙酸苯乙酯（OAV為23.48），賦予酒樣玫瑰香和草莓香。結果表明，乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯及乙酸苯乙酯是威士忌的關鍵香氣物質，對酒樣的香氣貢獻最大。

表5 不同酵母制備威士忌酒樣中揮發性香氣物質的氣味活度值Table 5 Odor activity value of volatile aroma substances in whisky samples produced by different yeasts

2.5 主成分分析

不同酵母制備威士忌酒樣風味物質主成分分析結果見表6，主成分的特征向量和載荷矩陣見表7，不同酒樣風味物質主成分分析PCA得分圖及載荷圖見圖2。

圖2 不同酵母制備威士忌酒樣風味物質主成分分析得分圖（a）及載荷圖（b）Fig.2 Principal components analysis scores (a) and loading plots (b) of flavor substances in whisky samples produced by different yeasts

表6 不同酵母制備威士忌酒樣風味物質主成分的方差貢獻率Table 6 Variance contribution rate of principal components of flavor compounds in different whisky samples produced by different yeasts

表7 主成分的特征向量和載荷矩陣Table 7 Characteristic vectors and loading matrix of principal components

由表6可知，不同酒樣風味物質共提取出兩個特征值＞1的主成分，兩個主成分的特征值分別是7.697和3.303，方差貢獻率分別為69.973%和30.027%，累計方差貢獻率為100%，說明2個主成分可以完整反應風味物質的信息。

由表7可知，第一主成分中載荷較高的風味物質有異戊醇、正丙醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯，載荷值的絕對值均大于0.8，其中正丙醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯為正相關，異戊醇為負相關，第一主成分的方差貢獻率為69.973%，說明第一主成分對酒樣風味影響最大。第二主成分中載荷值較大的風味物質有正丁醇、己酸乙酯、乙醛，載荷值的絕對值均＞0.78，其中正丁醇和乙醛為正相關，己酸乙酯為負相關，第二主成分的方差貢獻率為30.027%。

由圖2（a）可知，3種酒樣間區分較好，且不同酒樣分別位于圖的不同區域。由圖2（b）可知，酒樣ACBC-3位于第一主成分和第二主成分的負半軸，得分均小于0；酒樣ACBC-2位于第一主成分的負半軸和第二主成分的正半軸；酒樣ACBC-1位于第一主成分的正半軸和第二主成分的負半軸。

酒樣ACBC-3中異戊醇含量較高，因此主要分布在第一主成分和第二主成分的負半軸；酒樣ACBC-2中的正丁醇含量較高，因此主要分布在第一主成分的負半軸和第二主成分的正半軸；酒樣ACBC-1中乙酸乙酯、正丙醇、丁酸乙酯、己酸乙酯和乙酸苯乙酯含量較高，因此分布在第一主成分的正半軸和第二主成分的負半軸[25]。

2.6 不同酵母對威士忌酒樣風味物質影響的綜合評價

由表6可知，當提取2個主成分時累計方差貢獻率已經達到100%，因此兩個主成分就足夠描述不同酒樣的總體風味物質水平。采用PCA分析，得出F1和F2兩個綜合指標代替原來的11個指標對威士忌酒樣的風味物質進行分析，最終得到的2個主成分因子的方程如下：

式中：F1為各個酒樣中第一主成分的綜合指標，F2為各個酒樣中第二主成分的綜合指標，下同，X1～X11分別表示酒樣中各風味物質經過標準化處理的值。

根據PCA分析的結果，用各主成分的方差貢獻率作為權重，對兩個主成分得分進行加權求和，建立評價函數F=0.699 73F1+0.300 27F2，式中F表示各個酒樣的綜合評價分值，計算各酒樣的綜合評分，得出酒樣風味物質水平高低。不同酒樣的主成分得分及綜合得分見表8。

表8 不同酵母制備威士忌酒樣的主成分得分及綜合得分Table 8 Principal components scores and comprehensive scores of whisky samples produced by different yeasts

由表8可知，在3個酒樣中，酒樣ACBC-1綜合得分最高為1.87分，明顯高于其他酒樣，說明其風味較好，酒樣ACBC-2綜合得分為0.26，酒樣ACBC-3的綜合得分為負值（-2.13分），說明這兩個酒樣風味較差。

2.7 不同酵母制備威士忌的感官評價

不同酵母制備威士忌蒸餾酒酒樣的感官評分雷達圖見圖3。

圖3 不同酒樣感官評分雷達圖Fig.3 Radar chart of sensory evaluation of whisky samples produced by different yeasts

由圖3可知，在色澤方面，3個酒樣感官評分均為20分，酒液澄清透亮；在香氣方面，酒樣ACBC-1平均得分最高為27.8分，酒香愉悅；在滋味方面，酒樣ACBC-1平均得分最高為33.8分，酒體豐滿醇厚，果香純正；在典型性方面，酒樣ACBC-1平均得分為8.4分，典型明確，酒體組分較協調。酒樣ACBC-1感官評價綜合得分最高，總分為90分。

3 結論

該研究以大麥芽為原料，選用3種不同酵母發酵制備威士忌蒸餾酒。結果表明，酵母ACBC-1的發酵性能最好，其發酵液的理化指標良好（總酸3.73 g/L，殘糖3.00 g/100 g，酒精度6.42%vol，pH 4.1），出酒率最高（70.78 mL/kg）。3個酒樣共檢出24種風味物質，其中醇類化合物含量最多，占總含量的77%～98%；OAV＞1的酯類化合物種類最多（5種），其中乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯及乙酸苯乙酯是關鍵香氣物質，對酒樣的香氣貢獻最大。酵母ACBC-1制備威士忌感官評分為90分。因此，酵母ACBC-1是適合釀造威士忌的優良菌株。