牛欄山二鍋頭發酵過程中有機酸的變化規律

李 晴，于曉濤，劉軒墀，郝文軍，張 帆，柳 旭，王 瑛

（北京順鑫農業股份有限公司 牛欄山酒廠，北京 101301）

釀好中國白酒，講好中國白酒的故事，不僅是一個產業的傳承，更是一種文化的傳承。酒醅一般指在池內正在進行發酵或者已經發酵完成的糧食的混合物，酒醅中的淀粉在微生物、多種酶作用下經過糖酵解形成葡萄糖，最后由葡萄糖發酵成酒精[1]，由于酒醅發酵過程中微生物種類、數量、酶活性及各物質間轉換的復雜性，也決定了研究其在發酵過程物質代謝的必要性，目前已有報道對濃香型白酒釀造過程中淀粉、還原糖[2]含量變化，醬香型白酒酒醅揮發性物質[3]進行了分析，但對于二鍋頭發酵過程中物質變化的研究相對較少。

有機酸是酒醅發酵過程中酸味的重要組成部分，與酒體的品質密切相關[4]，同時有機酸是形成酯類的重要前提物質[5]，對酒體的香氣具有重要的貢獻[6]，目前，木薯酒[7]、葡萄酒[8]、果酒[9]在發酵、加工過程中有機酸的變化已有相關研究，而二鍋頭在發酵過程中有機酸含量的變化鮮有人報道，因此準確把握牛欄山二鍋頭在發酵過程中有機酸含量的變化，對優化生產工藝、指導生產至關重要。

本研究主要以牛欄山白酒發酵過程中酒醅為實驗材料，通過超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）和氣相色譜（gas chromatography，GC）對酒醅中的有機酸含量進行測定，同時檢測酒醅發酵過程中的溫度、微生物總數、總酸、pH值等指標變化，為進一步研究牛欄山白酒發酵過程提供了理論依據，為指導生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅樣品：取自順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠釀造車間，分別于入池后第1、2、3、5、9、11、13、17、22、28、36、45天進行取樣，每次采集3份樣品，-80 ℃保存。

1.1.2 試劑

甲醇（色譜純）：美國Fisher公司；超純水（三級水）：Milli-Q凈水儀制備；草酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、延胡索酸標準品（純度均＞98%），磷酸二氫銨（分析純）：天津市光復精細化工研究所；磷酸（分析純）：北京化工廠。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，去離子水1 000 mL，pH 4.0，115 ℃滅菌30 min。

乳酸菌分離培養基：牛肉膏10 g，酪蛋白胨30 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，吐溫-801mL，檸檬酸氫二胺2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，K2HPO42 g，MnSO4·H2O 0.25 g，萘啶酮酸50 mg，瓊脂15 g，去離子水1 L，pH 5.0，115 ℃滅菌30 min。

常規絲狀真菌分離培養基采用孟加拉紅培養基：北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

L95系列智能溫度記錄儀：上海發泰精密儀器儀表有限公司；BSC-1100ⅡA2型生物安全柜：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；SPX-320型生化培養箱：寧波江南儀器廠；Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀：美國Waters公司；5975C氣相色譜：美國安捷倫公司；Milli-Q Reference超純水發生器：美國Millipore公司；MS204TS/02萬分之一分析天平、FE22-Standard pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；GDANA電熱板：廣州格丹納儀器有限公司；BSD-YX2400智能精密搖床：上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 酒醅發酵過程中理化指標的測定

溫度：利用智能溫度記錄儀對酒醅[10]、地表以及環境溫度進行監測；總酸：利用酸堿中和法對酒醅中的總酸含量進行測定[11]；以氫氧化鈉消耗量表示酒醅的酸度，定義每克酒醅消耗0.1 mol/L NaOH溶液為1度。pH值：準確稱量10 g酒醅加入90 mL無菌水，靜置15 min，利用pH計對濾液pH值進行測定。

1.3.2 酒醅發酵過程中微生物數量的測定

樣品前處理：分別取不同發酵時間的酒醅，按四分法混合取樣后，稱量10g混合酒醅于90mL無菌水中，搖床180r/min振蕩10 min，制備的菌懸液定為10-1梯度，無菌環境下吸取1 mL于9 mL無菌水中，計為10-2，依次稀釋為10-3、10-4、10-5、10-6梯度。

培養條件：使用滅菌槍頭吸取上述不同梯度樣液0.1mL，涂布至不同分離培養基平板中，3個平行，設置空白對照。根據微生物的不同培養條件進行恒溫培養，酵母28 ℃靜置培養48 h，常規絲狀真菌30 ℃培養24～48 h，乳酸菌35 ℃靜置培養24～48 h。

微生物平板計數：根據培養結果挑選菌落數在30～300 CFU/mL的平板進行計數，乘以稀釋倍數計算不同微生物的菌落數量。

1.3.3 酒醅發酵過程中乳酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸及延胡索酸含量的測定

樣品前處理：準確量取5 g酒醅，溶于10 mL的提取液中，超聲提取20 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，待上機分析。

UPLC條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），二極管陣列檢測器（diode-array detector，DAD），柱溫35 ℃，樣品室溫度20 ℃，進樣體積10 μL，檢測波長210 nm，流動相為0.002 5 mol/L 磷酸二氫銨（NH4H2PO4）溶液，流速0.2 mL/min進行等度洗脫，進樣時間10 min。

定性定量方法：配制乳酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸及延胡索酸的混合標準溶液20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L，通過標準品保留時間對樣品中有機酸進行定性，以UPLC的檢測出峰面積（y）為縱坐標，以標品的質量濃度（x）為橫坐標，構建標準曲線，按照標準曲線回歸方程計算樣品中有機酸的含量。

1.3.4 酒醅發酵過程中乙酸含量的測定

樣品前處理：準確稱量5 g酒醅樣品，在60 ℃條件下進行固相微萃取30 min。

GC條件：固相萃取頭涂層50/30 μm DVB/CAR/PDMS，DB-Wax色譜柱（50 m×0.25 mm，0.2 μm），進樣口溫度250 ℃解吸5 min，升溫程序：初始溫度40 ℃，以3 ℃/min的速度升溫至80 ℃，保持3 min后，繼續以3 ℃/min的速度升溫至190 ℃維持15 min。

定性定量方法：以標準品保留時間進行定性，以乙酸正丁酯為內標物（質量濃度為17.6 g/L）進行半定量。

1.3.5 數據處理

采用Excel 2016、Origin 8.5軟件對實驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 酒醅發酵過程中溫度的變化情況

發酵過程中的酒醅溫度主要與入缸溫度、周圍環境以及發酵過程中微生物代謝產能等有關[12]，酒醅發酵過程中溫度的變化見圖1。由圖1可知，在整個發酵過程中，地溫較為穩定，基本維持在21 ℃，環境溫度受天氣影響較大，存在一定的起伏，最高溫度在發酵的第5天，為12.1 ℃，最低溫度在發酵的第43天，為-5.3 ℃。酒醅溫度受環境影響的同時，在一定程度上反映了酒醅中微生物活躍程度及物質代謝的變化，發酵初期，酒醅中存在大量氧氣，酵母菌、絲狀真菌等微生物利用酒醅中的氧氣進行有氧呼吸，產生大量的能量，促使酒醅中溫度逐漸升高，在第9天時溫度達到最高點，為29.2 ℃，此時酒醅中的微生物和物質代謝處于最活躍的階段，9 d以后，酒醅中的氧氣逐漸被消耗，微生物開始有氧呼吸和無氧呼吸相結合，酵母菌、細菌等利用葡萄糖進行發酵生成乙醇等物質，這個過程中物質代謝逐漸減緩，能量產生降低，酒醅溫度下降并逐漸趨于平穩。

圖1 酒醅發酵過程中溫度的變化Fig.1 Change of temperature of fermented grains during the fermentation

2.2 酒醅發酵過程中微生物數量的變化情況

發酵過程中微生物復雜的變化與有機酸等代謝物質的產生有著密不可分的聯系[13-14]，酒醅發酵過程中酵母菌、乳酸菌和絲狀真菌數量的變化見圖2。由圖2可知，發酵初期酵母菌、乳酸菌及絲狀真菌均大幅度增加，其中酵母菌、乳酸菌在7～11 d時達到最大值，絲狀真菌在第5 d達到最大值。酵母菌是酒醅發酵過程中十分重要的微生物之一，其能夠決定乙醇以及一些香氣成分的產生[15]，由圖2A可知，酵母菌在發酵開始的前3 d數量增長較為緩慢，5～9 d呈現急速的增長，在第11天達到最大值為77.7×106CFU/mL，13～17 d呈現大幅度下降，降低約53倍，酵母菌數量變化可能由于發酵初期，淀粉被大量消耗，營養物質豐富，酵母菌生長繁殖旺盛，乙醇逐漸增加，而發酵后期乙醇的大量積累，改變了營養結構，影響了酵母菌的生長繁殖[16]。乳酸菌對于酒體的放香至關重要，其能夠直接影響發酵過程中乳酸的形成，乳酸則是呈香物質乳酸乙酯合成的前體物質[17]。由圖2B可知，乳酸菌在發酵的3～5 d出現大幅度的增長，于第7天達到最大值247.7×106CFU/mL，7 d后乳酸菌逐漸下降，這一結果與以往的研究相一致[18]，其可能原因發酵后期酒醅中高酸環境不利于細菌生長。由圖2C可知，絲狀真菌與酵母菌和乳酸菌有所不同，發酵初期酒醅中存在大量的絲狀真菌，在發酵的第5天時絲狀真菌達到了最大值，為20.3×105CFU/mL，發酵5 d以后呈現出逐漸降低的趨勢。

圖2 酒醅發酵過程中酵母菌（A）、乳酸菌（B）和絲狀真菌（C）數量的變化Fig.2 Number changes of yeasts (A),lactic acid bacteria (B) and filamentous fungi (C) of fermented grains during fermentation process

2.3 有機酸含量的測定

2.3.1 有機酸標準曲線回歸方程的建立

乳酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸及延胡索酸的混合標準溶液UPLC分析色譜圖見圖3（A），乙酸GC分析色譜圖見圖3（B），標準曲線回歸方程見表1。

表1 5種有機酸線性回歸方程及相關系數Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of 5 kinds of organic acids

圖3 5種有機酸標準品超高效液相色譜圖（A）和乙酸氣相色譜圖（B）Fig.3 Ultra performance liquid chromatography of 5 kinds of organic acids standards (A) and gas chromatography of acetic acid (B)

由圖3可以看出，酒醅中的五種有機酸通過超高效液相色譜能夠良好的分離，出峰順序分別為：草酸（1.189 min）、蘋果酸（1.456 min）、乳酸（1.745 min）、檸檬酸（1.973 min）、延胡索酸（2.302 min）。

以5種有機酸標品的質量濃度為橫坐標，以對應的出峰面積為縱坐標，構建標準曲線，得到5種有機酸的回歸方程如表1所示，相關系數R2均＞0.99，符合要求，表明超高效液相工作性能穩定，能夠對酒醅中的有機酸進行準確的測定。

2.3.2 酒醅發酵過程中有機酸的變化情況

實驗利用超高效液相色譜對牛欄山酒醅發酵過程中的乳酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸及延胡索酸進行測定，同時，由于乙酸的沸點低，強揮發性的特點，對乙酸采用氣相色譜進行檢測，實驗結果見圖4。

圖4 酒醅發酵過程中有機酸含量的變化Fig.4 Change of organic acid contents of fermented grains during fermentation process

由圖4可知，在酒醅發酵過程中，乳酸和乙酸的含量較高，最高時可分別達到10.26 mg/g和5.16 mg/g。

白酒發酵過程中乳酸的含量對白酒的生成至關重要[19]，由圖4A可以看出，酒醅中乳酸的含量在13 d前呈現穩定增長的趨勢，在第9天出現一個降低點，含量為0.82 mg/g，13～22 d乳酸的含量呈現出大幅度的增長，增加了6.46 mg/g。乳酸是構成白酒風味的主要物質之一，主要由葡萄糖在乳酸菌和乳酸脫氫酶等作用下經糖酵解產生[20]，通過觀察發現在發酵初期，乳酸含量（圖4A）和乳酸菌數量（圖2B）均在不斷增加，為乳酸的積累創造了條件。

乙酸對于清香型白酒而言是更為關鍵的有機酸，是合成清香型白酒主要呈香物質乙酸乙酯的重要前提[21]，由圖4B可知，發酵開始前13 d，乙酸呈現出一定的波動，13 d以后乙酸的含量逐漸增加，在第28天時含量達到最大值為5.16 mg/L，發酵后期大量乙醇的產生促進了乙酸的積累。

檸檬酸是人體細胞代謝必不可少的酸，能夠促進乳酸的分解，幫助緩解人體疲勞[22]，由圖4C可知，檸檬酸的含量在28 d前呈現出較為穩定的狀態，而第9天出現一定的降低，含量降為0.07 mg/g，發酵28 d后，檸檬酸出現了大幅度的增加，達到0.025 mg/g。檸檬酸屬于不揮發性酸，其含量的增加能夠增強酒體的醇厚感，并與其他呈香呈味物質共同作用，從而能在一定程度上提高白酒的品質。

微生物代謝能夠產生大量的有機酸類物質，適量的有機酸積累能夠使酒體更加豐滿協調，蘋果酸雖然酸度較大，但卻擁有柔和的風味，能夠與其他有機酸共同作用在一定程度上影響酒體的風味品質，由圖4D可知，在酒醅發酵過程，蘋果酸在13 d前處于一種動態的平衡，含量在0.04～0.16 mg/g之間，作為三羧酸循環、蘋果酸-乳酸發酵過程等多種物質代謝途徑過程的中間樞紐，蘋果酸不僅在代謝中產生，同時也不斷被微生物等消耗[23]，在13～22 d發酵過程中，蘋果酸的含量急速增加，在第22天達到0.42 mg/g，同時觀察蘋果酸在28 d后的含量，發現其仍有上升的趨勢。

草酸是一種常見的二元酸，能夠參與調節Ca+、pH及滲透壓等生理學過程[24]。由圖4E可知，草酸的含量在前7 d呈現出上升的趨勢，在7～9 d有所降低，9 d以后開始不斷增加，到22 d含量達到一個最高值，為0.24 mg/g，草酸含量在28 d以后呈現下降的趨勢，避免了草酸的大量積累。

由圖4F可知，延胡索酸在前13 d均未被檢出，可能原因是延胡索酸在前13 d其產生量與其消耗量一致，延胡索酸在含量上保持動態的守恒，13～22 d延胡索酸的含量持續上升，增加了0.032 mg/g，22 d后延胡索酸的含量有所降低且隨著發酵的進行基本保持穩定。

從實驗結果可以看出，乳酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸隨著酒醅發酵的進行呈現出逐步增長的趨勢，且在第9天左右均出現一個低點，這一結果與曹云剛等[25]報道相一致，分析其可能原因在第9天時微生物的種類、數量處于一個高點（圖2），微生物代謝活動旺盛，酒醅溫度升高，酶活性增強，致使有機酸的消耗過大，導致其含量出現一定的波動，而延胡索酸則在發酵開始的13 d以后呈現出增長的趨勢，并且延長發酵時間（常規發酵時間28 d）在整體上會增加有機酸的積累。

2.4 酒醅在發酵過程中總酸和pH的變化情況

總酸是一個定數，本實驗指酒醅樣品最終能釋放出的氫離子數量；pH與H+的平衡相關，本實驗中指酒醅溶液中釋放氫離子（或氫氧根）的能力[26]，總酸和pH均能夠對酒醅中微生物的代謝產生影響，進而影響有機酸的形成。酒醅發酵過程中總酸含量及pH值變化分別見圖5和圖6。

圖5 酒醅發酵過程中總酸含量的變化Fig.5 Change of total acid contents of fermented grains during fermentation process

圖6 酒醅發酵過程中pH值的變化Fig.6 Change of pH of fermented grains during fermentation process

由圖5可知，總酸的含量隨著發酵的延長逐漸遞增，0～7 d總酸的增長速度較為緩慢，酒醅入缸時的總酸度為0.3度，經過36 d的發酵，總酸含量達到2.8度，同時通過對比有機酸的實驗結果，發現總酸的遞增規律與乳酸的遞增規律大致相同，且乳酸為發酵過程中重要的有機酸之一。

由圖6可知，酒醅的pH隨著發酵時間進行逐漸的下降，由酒醅開始入池的pH4.77降低到3.28，pH的結果與總酸的含量呈現出負相關性，說明酒醅中的總酸含量在一定程度上能夠影響酒醅的pH的大小。

3 結論

牛欄山二鍋頭發酵過程中酒醅的溫度在第9天出現最高點，達到29.2 ℃；酵母菌、乳酸菌及絲狀真菌均是先增加后降低，在7～11 d時左右其微生物的數量達到最大，與發酵過程中酒醅溫度的變化呈現出相關性；總酸度隨著發酵的進行而不斷升高，最后達到2.8度；pH隨著發酵的進行而不斷降低，最后下降到3.33。

通過超高效液相和氣相色譜測定牛欄山二鍋頭發酵過程中乳酸、乙酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸的含量，其中，大多數有機酸在第9天存在低點，9～28 d呈上升的趨勢，隨后保持緩慢增長，同時發現有機酸含量變化與乳酸菌變化呈顯著正相關，實驗的展開為提升牛欄山二鍋頭白酒品質提供了理論依據，今后可探究在傳統牛欄山二鍋頭發酵周期28 d的基礎上適當延長發酵時間，以提高有機酸含量，生產一些高品質的調味酒。