電子束輻照滅菌對(duì)昭通醬品質(zhì)影響研究

李俊杰，張正彪，李 浪，3，余平蓮*，臧永清

（1.昭通學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昭通 657000；2.云南省高校高原特色功能食品研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昭通 657000；3.云南食品安全昭通研究院，云南 昭通 657000）

我國(guó)醬類產(chǎn)品品種眾多，如大（黃）豆醬、豆瓣醬、牛肉醬、甜面醬、芝麻醬、花生醬等，其市場(chǎng)需求逐年增多，行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)良好[1-2]。昭通醬為昭通本地特有的大豆醬，呈鮮紅色，有濃烈的醬香味，因產(chǎn)于昭通而得名，其主要原料為大豆，富含多種活性物質(zhì)，對(duì)人體有保健功能。相比市面上其它豆醬，昭通醬有兩個(gè)比較明顯的特色。昭通醬是經(jīng)過兩次發(fā)酵周期制成的，第一次發(fā)酵主要是黃豆在自然條件下進(jìn)行發(fā)酵，以真菌發(fā)酵為主。第二次發(fā)酵是在一次發(fā)酵的基礎(chǔ)上經(jīng)過刷霉、粉碎、加料、攪拌等步驟進(jìn)行發(fā)酵，以細(xì)菌發(fā)酵為主。也因此傳統(tǒng)昭通醬加工至少半年才能制成。昭通醬屬于大豆發(fā)酵類醬制品，在生產(chǎn)和運(yùn)輸過程中，易造成微生物污染，影響醬本身的口感[3]。傳統(tǒng)大豆醬通常采用低溫密封包裝、干燥、氣調(diào)等技術(shù)進(jìn)行儲(chǔ)藏，但存在操作麻煩、成本稍高、殺蟲滅菌效果不徹底等缺點(diǎn)。陳書蓓[4]利用熱耦合超聲對(duì)黃豆醬進(jìn)行滅菌處理，發(fā)現(xiàn)豆醬中大腸桿菌和膜醭畢赤酵母菌的致死率與滅菌的時(shí)間和溫度符合動(dòng)力學(xué)模型；周民生[5]研究表明，豆醬能夠更好的保護(hù)真菌免受高溫高壓的影響，90 ℃條件下處理20 min，只能降低醬體中霉菌和膜醭畢赤酵母菌2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，而豆醬超高壓滅菌方式基本可行，且符合一定的動(dòng)力學(xué)原理。加熱處理能有效殺滅豆醬中部分微生物，但絕大多數(shù)分微生物甚至致病菌在加熱處理后仍然處于“亞致死”或者“存活但不可培養(yǎng)”的狀態(tài)，殘留的微生物又會(huì)進(jìn)一步污染樣品，因此大多數(shù)加熱滅菌需進(jìn)行二次熱處理[6]。電子束輻照滅菌其原理是將電子加速成高能電子產(chǎn)生電子射線，將電子射線能量轉(zhuǎn)移給被輻射物，使得被輻射物中微生物體內(nèi)發(fā)生電離，激發(fā)自由基等分子方面發(fā)生變化，從而達(dá)到殺菌的目的。因其殺菌效果明顯，不帶入新的雜質(zhì)，以及“冷殺菌”的特點(diǎn)備受關(guān)注[7]。BHAT R等[8]探究了不同劑量電子束輻照對(duì)蓮子的成分以及蛋白質(zhì)功能特性的影響，研究證明電子束輻照能夠延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期；KIM H J等[9]采用10 kGy及以下電子束劑量處理牛肉干，其殺菌有明顯的效果，而且并不影響其感官品質(zhì)；目前我國(guó)電子束輔助主要用于糧食、果蔬、畜禽肉類以及一些水產(chǎn)品類，而在醬類調(diào)味品中應(yīng)用卻少見。昭通醬在當(dāng)?shù)氐纳a(chǎn)加工主要按照傳統(tǒng)的工藝進(jìn)行作坊式生產(chǎn)，并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可參考，且由于發(fā)酵過程全在露天自然環(huán)境下進(jìn)行且周期長(zhǎng)，無論在發(fā)酵還是儲(chǔ)藏過程中容易生霉，熱殺菌又易導(dǎo)致風(fēng)味和色澤發(fā)生改變，因此很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。因此昭通醬長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展對(duì)策就是先實(shí)現(xiàn)包裝-滅菌等工序。考慮到昭通醬自身含有豐富的營(yíng)養(yǎng)和獨(dú)特的風(fēng)味成分，如果對(duì)其進(jìn)行傳統(tǒng)的加熱殺菌，勢(shì)必會(huì)使得產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)流失，甚至?xí)a(chǎn)生其他不好的風(fēng)味。因此，本實(shí)驗(yàn)以昭通醬的感官評(píng)價(jià)、部分營(yíng)養(yǎng)及理化成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究電子束輻照劑量對(duì)其品質(zhì)的影響，旨在為昭通醬在產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昭通醬：本實(shí)驗(yàn)室自制（原料產(chǎn)地昭通，無任何添加劑）；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯：北京路橋技術(shù)股份有限公司；二甲基亞砜、乙腈、甲醇（均為色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；6種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素）（純度均＞99%）：天康生物科技有限公司；磷酸、氫氧化鈉、五水硫酸銅、亞甲基藍(lán)、鄰苯二甲酸氫鉀、甲基紅、鹽酸、溴甲酚綠、乙酸鋅、冰乙酸、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、亞鐵氰化鉀、乙醇、氫氧化鉀、硼酸、酚酞、硫代硫酸鈉、石油醚、三氯甲烷、碘化鉀、無水硫酸鈉、可溶性淀粉、重鉻酸鉀、硫酸鉀、硫酸、堿性藍(lán)6B（均為分析純）：天津市津北精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（含G1314 B-二極管陣列檢測(cè)器（diode-array detector，DAD）、G1311 A 四元泵、G1316 A柱溫箱、G1329 A自動(dòng)進(jìn)樣器）：美國(guó)安捷倫公司；AUW-220 D 電子分析天平：日本島津公司；GW1030型超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；BDW 1-202-1ASB/1A恒溫干燥箱：北京中西華大科技有限公司；HH-1恒溫水浴鍋：北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司；TY15/ZX 10003分析天平：北京海富達(dá)科技有限公司；NKB 3300自動(dòng)凱氏定氮儀：上海祎鴻分析儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

實(shí)驗(yàn)室自制昭通醬用聚乙烯自封袋分裝（每袋500 g，攤平尺寸12 cm×10 cm×3 cm左右），進(jìn)行輻照。昭通醬的輻照處理在湖南湘華大生物科技有限公司進(jìn)行，輻照劑量設(shè)置為0、2 kGy、4 kGy、6 kGy、8 kGy、10 kGy、12 kGy，實(shí)測(cè)劑量分別為0.00、2.10 kGy、3.68 kGy、5.80 kGy、8.15 kGy、9.80 kGy、12.48 kGy，以上每個(gè)劑量設(shè)6個(gè)平行，每包樣品分別在上下兩面的中心和對(duì)角處貼上劑量計(jì)（片），實(shí)測(cè)劑量為各處平均劑量，不均勻度為單個(gè)樣品中最高劑量與最低劑量值得比值，本實(shí)驗(yàn)不均勻度控制在1.5以內(nèi)，輻照后的樣品均貯藏于4 ℃冰箱中待測(cè)。

輻照處理：依托湖南湘華華大生物科技有限公司，采用威視IS1020電子加速器，輻射源：反波型行波電子直流加速器，能量（10±0.5）MeV，額定工作束流功率（20±2）kW，掃描頻率5～20 Hz，連續(xù)可調(diào)。

1.3.2 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

表1 昭通醬的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of Zhaotong soybean paste

1.3.3 微生物指標(biāo)測(cè)定

菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》執(zhí)行[10]；霉菌：參照GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》執(zhí)行[11]；大腸菌群：參照GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》執(zhí)行[12]。

1.3.4 部分理化指標(biāo)測(cè)定

蛋白質(zhì)測(cè)定：參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》執(zhí)行[13]；脂肪測(cè)定：參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》執(zhí)行[14]；還原糖測(cè)定：參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測(cè)定》執(zhí)行[15]；過氧化值測(cè)定：參照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測(cè)定》執(zhí)行[16]；酸價(jià)測(cè)定：參照GB 5009.229—2016《食品中酸價(jià)的測(cè)定》執(zhí)行[17]；總酸的測(cè)定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》執(zhí)行[18]。

1.3.5 大豆異黃酮測(cè)定方法

參照GB/T 23788—2009《保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法高效液相色譜法》[19]進(jìn)行測(cè)定并略作改進(jìn)。

（1）分別取6種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液4 mg置于10mL容量瓶中，加入少量體積分?jǐn)?shù)50%的二甲基亞砜，超聲波處理30 min待其完全溶解，再用體積分?jǐn)?shù)50%的二甲基亞砜定容。6種大豆異黃酮溶液的質(zhì)量濃度均為400 mg/L。配制質(zhì)量濃度8.0 mg/L、16.0 mg/L、24.0 mg/L、32.0 mg/L、40.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）稱取樣品0.05～0.5 g（精確至0.1 mg），用體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶液至接近刻度。把樣品溶液用超聲波振蕩器600 W振蕩20 min，用體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶液定容，搖勻。取樣品溶液置于離心管中，5 000 r/min離心15 min，取上清液用0.45 μm濾膜過濾，收集濾液備用。

（3）液相色譜條件

C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：磷酸水溶液（pH=3.0），流速1.0 mL/min，波長(zhǎng)260 nm，柱溫30 ℃。

洗脫梯度：0 min 12%乙腈，10 min 18%乙腈，23 min 24%乙腈，30～50 min 30%乙腈，55 min 80%乙腈，56～60 min 12%乙腈。

1.3.6 氨基酸測(cè)定方法

結(jié)合GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》[20]和武俊瑞等[21]的方法略作改進(jìn)，增加了半胱氨酸的檢測(cè)，氨基酸的測(cè)定依托湖南省農(nóng)科院湖南省食品測(cè)試中心。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)需連續(xù)做3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析時(shí)取3次實(shí)驗(yàn)平均值進(jìn)行分析，采用Excel 2016軟件、Origin 9.0、IBM SPSS statistics 26等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻照劑量對(duì)昭通醬感官評(píng)價(jià)的影響

由表2可知，隨著輻照劑量的增加，昭通醬口感、氣味和滋味對(duì)輻照表現(xiàn)出一定的敏感性，當(dāng)輻照劑量為5.80 kGy時(shí)，氣味就開始發(fā)生一定的變化，但不影響滋味和口感，當(dāng)輻照劑量增加至8.15 kGy時(shí)，滋味和口感也開始發(fā)生改變，明顯能感受出一定的異味，當(dāng)輻照劑量增加至12.48 kGy時(shí)，色澤開始出現(xiàn)異常，顏色開始變暗，說明較高劑量會(huì)影響昭通的品質(zhì)。因此最佳輻照劑量不應(yīng)超過3.68 kGy。

表2 電子束輻照劑量對(duì)昭通醬感官評(píng)價(jià)的影響Table 2 Effect of electron beam irradiation dose on sensory evaluation of Zhaotong soybean paste

2.2 電子束輻照劑量對(duì)昭通醬微生物的影響

由表3可知，電子束輻照對(duì)昭通醬中微生物的數(shù)量影響顯著（P＜0.05），隨著輻照劑量的增加，昭通醬中菌落總數(shù)、真菌含量和大腸桿菌數(shù)量下降明顯，當(dāng)輻照劑量達(dá)到2.01kGy時(shí)，大腸桿菌數(shù)量達(dá)到最低檢出值以下；當(dāng)劑量達(dá)到3.68 kGy時(shí)真菌數(shù)量達(dá)到最低檢出值以下；當(dāng)輻照劑量達(dá)到8.15 kGy時(shí)，菌落總數(shù)降至最低檢出值以下，說明電子束輻照能有效抑制昭通醬中微生物數(shù)量，使其達(dá)到微生物商檢標(biāo)準(zhǔn)，延長(zhǎng)保鮮期。

表3 電子束輻照劑量對(duì)昭通醬微生物的影響Table 3 Effect of electron beam irradiation dose on microorganism of Zhaotong soybean paste

電子束輻照劑量與菌落總數(shù)、真菌數(shù)量和大腸桿菌數(shù)量均呈負(fù)相關(guān)，根據(jù)輻照劑量與菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的線性變化，可得出其回歸方程為y=-0.884 0x+7.052 8（R2=0.999 7），由此可計(jì)算出D10值（指殺滅90%微生物所需的輻射劑量）為1.16 kGy。當(dāng)輻照劑量為3.68 kGy時(shí)，昭通醬中菌落總數(shù)為未輻照時(shí)的0.07%，同時(shí)真菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)已低于最低檢測(cè)限，達(dá)到衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。電子束輻照是用電子加速器產(chǎn)生的高能電子束照射可使一些物質(zhì)產(chǎn)生物理、化學(xué)和生物學(xué)效應(yīng)[22]。食品中的含水量也會(huì)影響輻照滅菌的效果，因?yàn)樵诟稍餇顟B(tài)下照射，生成的游離基因失去了水的連續(xù)相而變得不能移動(dòng)，游離基等的輻射間接作用就會(huì)隨之降低，因而輻射作用顯著減弱[23-24]。而昭通醬作為一種特色醬類，其含水量比較高，因此在輻照過程中更容易發(fā)生電離，使微生物失活或者死亡。因此說明昭通醬的輻照劑量不宜超過3.68 kGy。

2.3 電子束輻照劑量對(duì)昭通醬部分理化指標(biāo)的影響

電子束輻照劑量對(duì)昭通醬部分理化指標(biāo)的影響見表4。由表4可知，隨著輻照劑量的增加，昭通醬的還原糖和蛋白質(zhì)含量呈略微下降的趨勢(shì)；脂肪含量先略微下降，當(dāng)輻照劑量超過3.68 kGy時(shí)下降明顯，后隨輻照劑量增加下降趨于平緩。隨著輻照劑量的增加，昭通醬的總酸含量幾乎不變；酸價(jià)值略微上升；而過氧化值隨著輻照劑量的增加而上升，當(dāng)輻照劑量超過9.80 kGy時(shí)，過氧化值上升明顯。因此根據(jù)輻照滅菌不應(yīng)改變營(yíng)養(yǎng)成分及理化指標(biāo)的原則，說明昭通醬的輻照劑量不宜超過3.68 kGy。

表4 電子束輻照劑量對(duì)昭通醬營(yíng)養(yǎng)及理化指標(biāo)的影響Table 4 Effect of electron beam irradiation dose on nutrition and physical and chemical indexes of Zhaotong soybean paste

2.4 電子束輻照劑量對(duì)昭通醬大豆異黃酮的影響

由表5可知，在輻照劑量為0～2.01 kGy時(shí)，染料木苷、大豆素、染料木素、大豆黃素和大豆黃苷5種大豆異黃酮含量呈略微上升的趨勢(shì)，當(dāng)輻照劑量為2.01～12.48 kGy時(shí)，含量隨著輻照劑量的增加逐漸減少，而且劑量越大下降速度越快；大豆苷的含量隨輻照劑量的增加始終呈下降的趨勢(shì)。這6種大豆異黃酮均含有羥基、碳氧雙鍵、碳氧單鍵和碳碳雙鍵，可能在輻照過程中發(fā)生脫氯化氫反應(yīng)與降解反應(yīng)，產(chǎn)生共軛雙鍵，含多官能團(tuán)不飽和的物質(zhì)會(huì)在輻照下產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)[25-27]。根據(jù)前人研究可知，多官能團(tuán)不飽和單體在輻照引發(fā)下優(yōu)先產(chǎn)生自由基并自聚[28-29]，這很可能是大豆異黃酮含量隨著輻照劑量的增加而下降的主要原因。從變化趨勢(shì)可知當(dāng)輻照劑量達(dá)到5.80 kGy時(shí)，6種大豆異黃酮含量下降趨勢(shì)明顯，且下降幅度開始增大，因此從大豆異黃酮的指標(biāo)分析，昭通醬電子束輻照劑量不宜超過3.68 kGy。

表5 電子束輻照劑量對(duì)昭通醬中6種大豆異黃酮含量的影響Table 5 Effect of electron beam irradiation dose on 6 soybean isoflavones content of Zhaotong soybean paste

2.5 電子束輻照劑量對(duì)昭通醬氨基酸的影響

電子束輻照劑量對(duì)昭通醬氨基酸含量的影響見表6。由表6可知，昭通醬中共檢測(cè)出17種氨基酸，主要由賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和谷氨酸組成。隨著輻照劑量的增加，其中賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、組氨酸和脯氨酸呈微上升趨勢(shì)，異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸和絲氨酸呈下降趨勢(shì)。當(dāng)輻照劑量達(dá)到5.80 kGy時(shí)，必需氨基酸（essential amino acid，EAA）、總氨基酸（total amino acid，TAA）、SAA和呈味氨基酸（delicious amino acids，DAA）的變化明顯，結(jié)合表4中蛋白質(zhì)含量隨輻照劑量的增加而微微下降，有可能因?yàn)殡S著輻照劑量的增加，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的水解，從而導(dǎo)致氨基酸含量的增加，從DAA/TAA值看，低劑量輻照對(duì)呈味氨基酸的變化影響較小，當(dāng)輻照劑量超過9.80 kGy時(shí)，DAA/TAA值下降明顯，說明此時(shí)昭通醬中風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生了明顯的改變。電子束滅菌對(duì)昭通醬中氨基酸的形成有一定的促進(jìn)作用，但光靠考察氨基酸含量的變化不能直接表明輻照對(duì)昭通醬的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)有一定積極作用，因此從保證樣品原有的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)特征的前提下，昭通醬的電子束輻照劑量不宜超過3.68 kGy。顧可飛等[30]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中，蛋氨酸及蛋白質(zhì)特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)電子束輻照相對(duì)敏感；梅卡琳等[31]的研究也表明，電子束輻照對(duì)蟹肉的氨基酸組成及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值沒有明顯的不利影響，與本研究結(jié)果基本類似。

表6 不同劑量電子束輻照處理昭通醬中的氨基酸組成Table 6 Amino acid composition of Zhaotong soybean paste treated by different doses of electron beam irradiation

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以昭通醬的感官評(píng)價(jià)、部分營(yíng)養(yǎng)及理化成分為考查指標(biāo)，研究電子束輻照劑量對(duì)其品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，當(dāng)輻照劑量為2.01 kGy時(shí)，昭通醬中大腸桿菌含量降到最低檢測(cè)水以下，此時(shí)脂肪的含量開始呈下降趨勢(shì)，過氧化值開始上升，大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素5種大豆異黃酮含量呈微微上升的趨勢(shì)，大豆苷呈下降趨勢(shì)；當(dāng)輻照劑量為3.68 kGy 時(shí)，昭通醬中真菌數(shù)量已經(jīng)下降到最低檢測(cè)水平以下，脂肪的含量繼續(xù)呈下降趨勢(shì)，下降速度減緩，當(dāng)輻照劑量達(dá)到5.80 kGy時(shí)，昭通醬氣味開始有所改變，而且6種大豆異黃酮含量下降變的明顯；當(dāng)輻照劑量為8.15 kGy 時(shí)，口感和滋味開始發(fā)生改變，菌落總數(shù)含量已經(jīng)下降到最低檢測(cè)水平以下，此時(shí)氨基酸含量變化明顯，過氧化值和酸價(jià)值變化變大；當(dāng)輻照劑量為9.80 kGy時(shí)，口感、氣味和滋味變化嚴(yán)重，產(chǎn)生了一些不愉快的氣味和滋味，脂肪含量繼續(xù)小幅度下降，氨基酸含量繼續(xù)變化；當(dāng)輻照劑量為12.48 kGy時(shí)，昭通醬色澤開始變暗，過氧化值上升速度和幅度加快，大豆異黃酮下降速度變快，氨基酸含量開始變少，特別是呈味氨基酸下降比較明顯。因此根據(jù)各指標(biāo)變化情況，表明3.68 kGy電子束輻照劑量既能殺死昭通醬中大多數(shù)微生物，使得菌落總數(shù)為未輻照時(shí)的0.07%，延長(zhǎng)貨架期，又能最大限度保持昭通醬中原有的理化指標(biāo)及風(fēng)味成分，是有效的昭通醬輻照滅菌劑量。