米麥曲米酒揮發性風味物質、氨基酸與感官評價的相關性

嚴 沁，伍文馳，張楷正

（四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000）

善釀酒色澤深黃清亮，香氣特盛，酒度適中，口味甜美，酒精度＞12.0%vol，屬半甜型黃酒；清酒以大米與天然礦泉水為原料，經過制曲、制酒母、復合發酵等工序，釀造出酒精度達18%vol的酒醪，再加入石灰使其沉淀，經過壓榨制得[1-2]。米麥曲酒結合了善釀酒與清酒的釀造工藝，在制作過程中，一部分大米蒸熟，冷卻后添加生麥芽和米曲霉制成米麥曲[3-4]；一部分大米預先通過精磨去掉糠皮和糊粉層得到精米，達到70%的精米率，再經過蒸煮制酒[5-6]，將前兩部分物料混合并添加適量的酵母和水制成酒母，將酒醪糖化發酵等后續工序制成米麥曲酒。

近年來，微量及痕量成分分析檢測技術的發展，如乙醚萃取濃縮、頂空、固相微萃取等樣品前處理技術及常用的檢測儀器氣相色譜-質譜（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）、氣相色譜-火焰離子化檢測器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）、全二維氣相質譜、毛細管電泳-電化學檢測法等，推動了釀造酒的風味研究[7-10]。氨基酸是影響釀造酒感官評價的重要因素，尤其對酒體和口感影響較大[11]。在酒體方面，氨基酸的含量會影響釀造酒的色澤。一般來說，氨基酸的含量越高，酒體色澤越深，含量越低，則顏色越淺；在口感方面，氨基酸一般呈甜、鮮、酸、苦和澀的味道，其呈味特性使得其對釀造酒的口感有極大的影響，甚至中國黃酒與其他酒種的一大區別就是“氨基酸味”[12-13]。李妍等[14]采用高效液相色譜法測定黃酒中的氨基酸含量，并結合多元統計方法對黃酒的產地進行判別；孫軍勇等[15]研究了氨基酸與黃酒中蛋白質渾濁的關系，發現谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸可能是造成蛋白質渾濁的主要原因；張楷正等[16]研究了傳統咂酒中氨基酸含量的配比，對匝酒的氨基酸營養進行了評價；丁學利[17]研究了枸杞干果酒中氨基酸含量的變化，發現氨基酸在發酵過程中都是先升高后降低；田翔等[18]使用超高效液相色譜法，同時檢測了黃酒中的17種氨基酸，該檢測方法快速，準確且回收率高等[19]使用高效液相色譜檢測葡萄酒和啤酒中的24種氨基酸；REDRUELLO B等[20]使用超高效液相色譜法，同時檢測啤酒中的21種氨基酸。

米麥曲酒的香氣是由酒中的各種風味物質提供的，而其口味又很大程度上受氨基酸的影響[21]，本研究采用氣相色譜-質譜聯用儀、氨基酸全自動分析儀結合感官評價對自制干型米麥曲酒的風味物質、氨基酸含量進行測定，嘗試用多元線性回歸方法，研究感官評價與米麥曲酒中風味物質、氨基酸含量之間的相關關系，以期對酒類風味與口感的關系，提供了一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干型米麥曲酒（dry Mimaiqu rice wine，DMRW）（17.89±0.67）%vol：自制；黃酒（Chinese rice wine，CRW）（古越龍山金5年陳，14%vol）：四川省自貢市沃爾瑪超市；清酒（Japanese sake，JNS）（獺祭50，16%vol）：日本購買；清酒酵母ACCC20045：實驗室保存；安琪生香酵母：安琪酵母有限公司。

氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；2-辛醇（色譜純）：百靈威科技有限公司；無水乙醇（色譜純）、正己烷、乙醚、三氯甲烷（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司；無水硫酸鈉、三氯乙酸、濃鹽酸（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

57330-U SPME手動進樣手柄：美國Supelco公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：上海安譜實驗科技股份有限公司；6790N-5975B氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent科技有限公司；N-Evap氮吹儀：上海思伯明儀器設備有限公司；L-8900氨基酸全自動分析儀：日本HITACHI公司；CF15R高速離心機：日立集團；DHG-9123A電熱干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米麥曲酒工藝流程及操作要點

大米的蒸煮：選擇完整無殘缺的糙米和精米，經過浸泡洗滌后自然瀝干，于110 ℃蒸制45 min。糙米熟米飯和精米熟米飯的混合比例為3∶7。

米麥曲的制備：小麥在35 ℃培養24 h得到麥芽，將麥芽與熟米飯軋碎，按2.5∶6.0比例混合，同時加入小麥質量30%的水，拌勻，按原料質量0.7%接入麩皮種曲（菌種為米曲霉蘇-16），35 ℃培養48 h，出曲。

米麥曲、酵母的添加：米麥曲的添加量在20%～25%；先將清酒酵母和安琪生香酵母活化，再在YPD液體培養基中純培養24 h，達到107CFU/mL，然后兩種酵母按原料質量的3%～8%與米麥曲混合。

酒母的制作：加入蒸飯和米麥曲之后添加一定比例的水，在56 ℃高溫糖化5 h，然后加入0.7%乳酸酸化1 h，冷卻后在無菌條件下加入酵母，密封后在生化培養箱中30 ℃培養24 h。

發酵時間：以CO2失重法判斷米麥曲酒的發酵時間，以CO2失重為零作為發酵終點。

糖化發酵溫度：借鑒日本清酒低溫發酵技術，糖化發酵溫度一般在10～20 ℃，發酵溫度在15 ℃左右。

投料方式：選擇多段式投料方法，避免一次性大量投料，否則由于酒母中的酵母增殖不夠充分，使得雜菌有生長空間，降低酒的品質。按照經驗，選擇3段式投料方法，3段投料比例為1∶2∶4。

壓濾：用濾袋或自動壓榨機壓濾。

澄清、過濾：在澄清罐中低溫靜置10 d，用過濾機添加一定量活性炭過濾。

煎酒：溫度控制在85～90 ℃，時間控制在2～3 min。

老化：采用10 ℃低溫冷藏半年到一年，即得米麥曲酒。

1.3.2 感官評價[12]

米麥曲酒感官評價在一個密閉無異味的房間中進行，采用編號盲評的方法進行，具體方法參考文獻[12]，感官評價員由6位具有豐富經驗的專業人士組成。感官評價分為香氣評價（15分，其中醇香、清香和果香分別占5分）和口味評價（15分，其中清爽、柔和和醇厚分別占5分）。評分標準根據各項目的品評結果由弱到強為1～5分，取6位品評員的平均值為最終結果。

1.3.3 揮發性風味物質和氨基酸的定量分析

（1）揮發性風味物質GC-MS分析

GC條件：AgilentHP-5MS毛細管色譜柱（30.0m×0.2mm×0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；分流比50∶1；程序升溫條件：40 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至120 ℃，再以8 ℃/min升至230 ℃保持6 min；載氣：99.999%氦氣（He），載氣流速：1 mL/min。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度為280 ℃，四極桿溫度為150 ℃，質量掃描范圍為30～550 amu，溶劑延遲2 min。

定性定量方法：樣品中未知揮發性成分通過工作站美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）11標準譜庫自動檢索，導出樣品檢索報告后篩選匹配，保留匹配度＞80的物質。使用內標法對米麥曲酒中風味物質含量進行半定量，內標物為色譜級2-辛醇（質量濃度為10 mg/100 mL），以內標物峰面積與各個風味物質峰面積的比值來確定風味物質的含量。

根據各個物質的閾值，確定米麥曲酒中各個風味物質的氣味活度值（odor activity value，OAV）＞1的風味物質作為米麥曲酒的主要風味物質[22]。

（2）氨基酸分析

供試酒樣中的游離氨基酸采用氨基酸全自動分析儀[23]，即53 min短程序（包括洗柱和沖柱時間）。酒樣預處理：酒樣過濾后，每10 mL加入40 mL的10%三氯乙酸除去蛋白質，使用高速離心機5 000 r/min離心10 min，取上層清液在電熱干燥箱中50 ℃反復烘干3次去除醇類物質，然后用0.02 mol/L的HCl溶液定容至10 mL，離心后取1 mL上清液直接上機檢測。

1.3.4 數據處理

采用SPSS 20.0、Graphpad Prism 8.0進行多元線性回歸分析。

2 結果與分析

2.1 干型米麥曲酒感官評價結果

2.1.1 香氣評分

對干型米麥曲酒的3種香氣評價醇香、清香和果香進行打分，結果見表1。根據李博斌等[24]的方法，將3種香氣評價平方根之后加和（在數據處理上，使用平方根加和的原因是更利于回歸分析），從而得到一個總的香氣評分。

表1 米麥曲酒香氣評價結果Table 1 Results of aroma evaluation of Mimaiqu rice wine

2.1.2 口感評分

根據李博斌等[12]的方法略作修改，對3種口味評價清爽、柔和和果香進行評分，結果見表2。

表2 米麥曲酒口感評價結果Table 2 Results of taste evaluation of Mimaiqu rice wine

2.2 三種酒樣中揮發性風味物質測定結果

由表3可知，DMRW中OAV＞1的物質有7種，分別是正己酸乙酯（118.14）、辛酸乙酯（763）、乙酸異戊酯（129.67）、乙酸苯乙酯（19.1）、苯乙醇（1.1）、苯乙醛（2.04）和壬醛（9.33），這些物質對米麥曲酒的風味貢獻較大。其中苯乙醛（0.051 mg/L）和壬醛（0.140 mg/L）的含量雖然較低，但由于它們的閾值很低，在低濃度下也具有較強的呈香作用，因此也是米麥曲酒的主要風味物質；而某些含量較高的物質，如乙酸乙酯（5.030 mg/L）和異戊醇（10.907 mg/L）等，由于香氣閾值較高，在高濃度下才具有呈香作用，因此不是米麥曲酒的主要風味物質。JNS和CRW中OAV＞1的風味物質分別為7種和6種，JNS的主要風味物質有正己酸乙酯（481.5）、辛酸乙酯（1103）、癸酸乙酯（8.54）、丁酸乙酯（6.55）、乙酸異戊酯（18.93）、己酸（2.39）和辛酸（1.1）；CRW的主要風味物質分別是正己酸乙酯（38.29）、辛酸乙酯（376.2）、癸酸乙酯（4.165）、蘑菇醇（19）、苯甲醛（1.82）和苯乙醛（1.88）。

表3 三種酒樣的揮發性風味物質含量、氣味描述及氣味活度值Table 3 Contents of volatile flavor compounds,odor description and odor activity values of 3 rice wine samples

續表

2.3 三種酒樣中游離氨基酸的測定結果

由表4可知，3個酒樣中共檢出游離氨基酸（free amino acid，FAA）17種，包含6種必需氨基酸（essential amino acid，EAA）和11種非必需氨基酸（non-essentialaminoacid，NEAA）。3個酒樣中總氨基酸（total amino acid，TAA）含量最高的是CRW，達到了281.44 mg/100 mL，DMRW的TAA為147.41 mg/100mL，最低的是JNS，含量為91.65 mg/100 mL。CRW中含量最高的氨基酸是Pro，其次是Ala和Asp；JNS中Arg含量最高，其次是Ala和Asp；DMRW中Pro含量最高，Ala和Asp次之。DMRW使用的酒曲中含有一定量的小麥，且大米的精米率為70%，蛋白質損失較少，因此TAA高于JNS，但低于CRW。EAA/TAA比值最高的是SMRW，最低的是JNS；EAA/NEAA比值最高的是SMRW，超過50%，其余3種酒樣均較低。

表4 三種酒樣中氨基酸含量測定結果Table 4 Determination results of amino acid contents in 3 rice wine samples

2.4 多元線性回歸分析結果

2.4.1 香氣評分與揮發性風味物質含量的回歸分析

將酒樣中OAV＞1的風味物質作為研究對象，共21種風味物質。將這21種物質的含量與香氣評價的平方根進行多元線性回歸分析，結果見表5和圖1。

由表5和圖1可知，線性回歸分析的結果中，揮發性風味成分含量與“醇香”的相關性較高，其總相關系數R2達到0.857，擬合度較好。通過相關系數R2可以發現，乙酸乙酯、異丁醇、異戊醇、蘑菇醇和苯甲醛與“醇香”呈正相關，其顯著水平達到了顯著相關；正己酸乙酯與“醇香”呈顯著的負相關。風味物質含量與“清香”和“果香”的相關性中等（R2接近0.8或R2＜0.8），其回歸的相關系數R2分別為0.811和0.760，擬合一般，其中辛酸乙酯和己酸與“清香”呈現顯著的正相關（P＜0.05），而異丁醇與“清香”呈現極顯著的負相關（P＜0.01），蘑菇醇與“清香”呈現顯著的負相關（P＜0.05）；風味物質中的正己酸乙酯、辛酸乙酯、己酸與“果香”呈顯著的正相關（P＜0.05），異丁醇與“果香”呈現極顯著的負相關（P＜0.01），異戊醇、蘑菇醇和苯甲醛與“果香”呈現顯著的負相關（P＜0.05）。傳統意義上認為的釀造酒主要香氣物質乙酸乙酯，并沒有在“清香”和“果香”中呈現顯著性關系，并且其相關系數為負，這一點與李博斌[12]的研究是相符合的，而正己酸乙酯在“清香”和“果香”中均表現出顯著的正相關（P＜0.05），這一點與TAKAHASHI K等[25]的研究相符合。通過整個酒樣的香氣評分值與風味物質含量的回歸模型可以看出，其相關系數R2為0.747，表明擬合度較低，說明揮發性風味物質含量與酒樣的總體香氣感官評價的相關性不高。其中，與香氣評價有顯著相關關系的物質是辛酸乙酯、異丁醇和蘑菇醇，辛酸乙酯與香氣評價呈現顯著的正相關（P＜0.05），蘑菇醇與香氣評價分別呈現極顯著的負相關（P＜0.01），異丁醇與香氣評價呈現顯著的負相關（P＜0.05）。乙酸乙酯的含量與總香氣評分不具有顯著的相關性（P＞0.05），且其相關系數R2為負數，無法對釀造酒的香氣評價體現積極的作用。

圖1 揮發性風味物質與香氣評價的相關性Fig.1 Correlation between volatile flavor substances and aroma evaluation

表5 揮發性風味物質與香氣評價的回歸分析結果Table 5 Results of regression analysis for volatile flavor compounds and aroma evaluation

2.4.2 口感評分與氨基酸含量的回歸分析結果

將酒樣中的17種氨基酸含量與口味的感官評價作多元線性回歸分析，結果見表6和圖2。

由表6和圖2可知，酒的感官評價中，“清爽”的評分值與氨基酸的含量的線性擬合一般，其相關系數R2為0.805，單個氨基酸中，“清爽”與各氨基酸的含量均呈現負相關，其中Val、Met、Lle、Leu、Lys、Asp、Gly、Ala、His和Pro與“清爽”呈現顯著的負相關（P＜0.05），這可能是因為氨基酸的含量過高，會使得酒味更加醇厚，反而失去了清爽的口感。其中Lys、Leu和Lle的相關系數R2最高，分別為-0.913、-0.908和-0.907，而這三種氨基酸都是苦味氨基酸，釀造酒中“清爽”受這些氨基酸的影響較大?！叭岷汀迸c氨基酸含量的回歸模型相關系數R2為0.549，擬合程度低，說明氨基酸含量與釀造酒口感中的“柔和”相關關系不強。從單個氨基酸來看，Glu和Arg與“柔和”有著顯著的相關關系，它們的相關系數R2分別為0.745和0.783。氨基酸含量與“醇厚”的回歸擬合十分良好，其相關系數R2為0.937，說明氨基酸含量的高低顯著影響釀造酒濃醇的口感。幾乎所有的氨基酸都與“醇厚”的評分有顯著的正相關（P＜0.05），這說明氨基酸的甜、鮮、苦和澀味對口感中“醇厚”的評分都有正向的影響，鮮味和甜味越重，口感越醇厚，而苦味和澀味更加能豐富釀造酒的口感，使得釀造酒更加醇厚。從口感的總評分與氨基酸含量的回歸關系來看，口感評分與氨基酸含量的線性擬合較低，相關系數R2為0.667，其中與口感評分呈顯著相關關系的氨基酸是鮮味氨基酸Thr和Glu，甜味氨基酸Ser，既呈苦味又呈鮮味的Phe，這些氨基酸與口感評分都呈現正相關，而其他氨基酸與口感評分呈現負相關的氨基酸均不存在顯著性（P＞0.05）。因此，雖然總感官評分與氨基酸含量的相關性較低，但是從單個氨基酸來看，某些氨基酸如Thr、Glu、Ser和Phe含量的增高，對釀造酒的口感還是具有顯著的提升（P＜0.05）。

表6 氨基酸與口味感官的回歸分析結果Table 6 Results of regression analysis for amino acids and taste sensory

圖2 氨基酸與口感評價的相關性Fig.2 Correlation between amino acids and taste evaluation

3 結論

本研究對揮發性風味物質含量、氨基酸含量與感官評價中的香氣評價、口感評價進行了分析，并采用多元線性回歸分析。結果表明，揮發性風味物質含量與總香氣評價相關性不強（R2=0.747）、與“醇香”相關性較強（R2=0.857），其中辛酸乙酯與香氣評價呈現顯著的正相關（P＜0.05），而異丁醇與香氣評價呈現極顯著的負相關（P＜0.01）。氨基酸含量與總口感評價相關性不強（相關系數R2=0.667）、與“醇厚”有顯著的正相關（R2=0.937）（P＜0.05）、與單“清爽”有較強的負相關（R2=0.805），其中蘇氨酸（Thr）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）和苯丙氨酸（Phe）與口感評分均呈現顯著的正相關（P＜0.05）。

米麥曲酒中的風味物質含量十分豐富，多種化合物柔和交織，形成了復雜的香氣和口感。研究各種風味物質包括氨基酸與米麥曲酒感官評價之間的相關性，對米麥曲酒的研究提供一定的理論依據。