微生物法生產蝦青素的研究進展

張 辰，徐 慧，朱坤福，姚明靜，劉建軍，馮 苗，王珊珊，祝 蕾，田延軍

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）山東省食品發酵工業研究設計院，山東 濟南 250013；2.山東朱氏藥業集團有限公司，山東 菏澤 274300）

蝦青素是目前經濟價值和應用價值較高的類胡蘿卜素物質，由于其多方面的生理功能而引起人們極大重視。蝦青素具有比維生素E、β-胡蘿卜素更強的抗氧化活性[1]，可以有效抑制細胞的氧化損傷和癌變[2]，同時還具有抗高血壓、預防心血管疾病、增強免疫、防紫外線輻射等諸多功效。此外，由于其具有抗氧化特性以及其他生理生化活性，蝦青素還可以作為食品添加劑[3]。因此，蝦青素在醫藥、食品、飼料、保健品和化妝品等領域的應用與日俱增。

本文介紹了蝦青素的結構性質、蝦青素來源和生產方法，著重講述紅法夫酵母（Phaffia rhodozyma）生產蝦青素的生物合成途徑、發酵培養條件以及蝦青素的破壁提取和純化方法，為蝦青素工業化生產提供一定理論基礎。

1 蝦青素的性質與結構

蝦青素是萜烯類不飽和化合物，化學名為3,3'-二羥基-β,β'-胡蘿卜素-4,4'-二酮，分子式為。在100 kPa條件下，熔點為216 ℃，沸點為774 ℃[5]。蝦青素具有疏水性，在室溫條件下易溶于苯、氯仿、丙酮和二甲亞砜等有機溶劑中[6]，微溶于甲醇、乙醇和石油醚等極性較大的有機溶劑中。蝦青素對光、氧、溫度等因素敏感，容易發生降解反應從而失去生物活性。

天然蝦青素由4個異戊二烯結構組成的長的共軛雙鍵碳鏈和兩端α-羥基酮的六元環構成，分子結構與β-胡蘿卜素類似。2個六元環上的羥基，構成手性中心，形成了蝦青素3種不同的構型：左旋（3S-3'S），右旋（3R-3'R）和內消旋（3R-3'S）。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）中按干質量計算含有1.5%～3.0%的（3S-3'S）蝦青素，主要以蝦青素雙酯和蝦青素單酯的形式[7]。1972年，PHAFF H J[8]研究發現，紅法夫酵母可以合成蝦青素，產生右旋構型（3R-3'R）的蝦青素。目前，已知只有紅法夫酵母產生（3R-3'R）構型的天然蝦青素，此種天然構型的蝦青素在人體的生物利用率更高[9]。

2 蝦青素的天然來源和生產方法

2.1 天然來源

蝦青素廣泛存在于動物（如水生動物、鳥類）、植物、真菌、藻類和細菌中。野生鮭魚從食物鏈中獲得蝦青素，但養殖鮭魚從含蝦青素的飼料中獲得鮭魚肉的特征顏色[10]。火烈鳥羽毛的艷麗顏色也是因為蝦青素的存在。蝦青素的含量和存在狀態在動物體內有所不相同，如三文魚的肌肉、內臟器官和血漿的蝦青素以游離態為主，而皮、魚鱗和魚籽中所含蝦青素主要以酯化形式存在。動物體均不能自行從頭開始合成蝦青素，需要攝入的藻類、酵母、植物來獲得蝦青素[11]。目前，蝦青素應用廣泛，消費需求不斷增加，僅依賴于食物鏈中存在的蝦青素含量不足以滿足各大行業需求。現有蝦青素的生產方法主要包括化學合成法、天然提取法和生物合成法。

2.2 生產方法

2.2.1 化學合成方法

利用多步化學和生物催化反應來生產蝦青素的方法稱為化學合成法。根據合成方法的差異，化學合成法又分為半合成法和全合成法。半合成法是以蝦青素代謝途徑中的前體物質（如葉黃素、角黃質）為原料來制備蝦青素的方法；全合成法即完全利用化學合成的方法來獲得蝦青素的方法[12]。化學合成蝦青素具有生產成本較低、產量高、蝦青素純度可達96%以上等優點[13]。但化學合成的蝦青素是多種構型的混合物，并含有副產物，在生物體內的吸收利用率較低[14]，穩定性、安全性以及抗氧化活性低于天然提取的蝦青素[15]。

2.2.2 天然提取法

海洋生物中多存在天然蝦青素，采用粉碎蝦、蟹等富含蝦青素的加工副產品、去除石灰質、利用有機溶劑等方式提取蝦青素的方法稱為天然提取法。這種制備方式能促進養殖業的發展，同時減少廢棄水產品副產物對環境的污染。但由于廢棄的蝦、蟹中甲殼中灰分、幾丁質含量高，而蝦青素的含量低會造成提取過程復雜，存在提取費用高的問題[16]。

2.2.3 微生物發酵法

利用酵母、藻類和細菌生產蝦青素的方法稱為微生物發酵法。主要菌種包括：單細胞綠藻雨生紅球藻、銅綠小球藻（Chlorella aeruginosa）[11]、紅法夫酵母[17]、粘紅酵母（Rhodotorula rubra）、膠紅酵母（Rhodotorula glutinosa）[18]和副球菌屬（Paracoccus）[19-20]。發酵法生產的蝦青素結構明確、副產物少、對環境友好。但受到產量低、培養條件要求嚴格、培養成本高等因素的制約。使用廉價培養原料、選育優質的高產菌種使其可以應用于工業生產是微生物發酵法生產蝦青素的關鍵因素。

3 產蝦青素的微生物

3.1 藻類生產蝦青素

許多藻類都可以產生蝦青素，如雨生紅球藻、衣藻（Chlamydomonas）、傘藻（Acetabularia）、裸藻（Euglena）等。雨生紅球藻是一種淡水單細胞綠藻，屬于綠藻門，團藻目，紅球藻科，紅球藻屬，是蝦青素生產的主要藻類。雨生紅球藻胞內蝦青素主要以雙酯化蝦青素和單酯化蝦青素存在，少量以游離態形式存在。但雨生紅球藻的生長時間長，培養條件要求嚴苛，需要光照，生產場所受限，并且蝦青素存在于厚壁孢子中，提取率低、連續性較差[21-23]。衛生部在2010年批準雨生紅球藻為新資源食品；自此，多種富含雨生紅球藻蝦青素的保健食品陸續得到國家食品藥品監督管理局的批準，這些舉措對推動蝦青素產品的研究開發及產業快速發展具有積極意義[24]。

銅綠小球藻是另一種產生天然蝦青素的綠藻。銅綠小球藻的蝦青素含量低于雨生紅球菌，但這種藻類具有特殊的培養優勢。銅綠小球藻是一種好氧的異養生物，可以使用葡萄糖作為唯一的碳源，生長快，可達到超高細胞密度，對不利的環境條件敏感性低以及易于在室內和室外進行培養。

3.2 細菌生產蝦青素

蝦青素存在于短桿菌（Brevibacterium）、副球菌屬、乳酸分支桿菌（Mycobacterium lacticola）等多種細菌中。盡管大多數細菌的蝦青素含量遠低于藻類和紅法夫酵母[25-27]，但通過在細菌中導入蝦青素合成相關基因，可改善細菌產蝦青素低的問題。尤其是革蘭氏陰性菌[28]的細胞壁薄易破碎，色素易提取，適合進行大規模高密度發酵培養[11]。通過細菌發酵生產蝦青素，可大幅度降低天然蝦青素的生產成本，對未來蝦青素的工業生產具有重要意義。

3.3 酵母生產蝦青素

酵母發酵生產蝦青素，主要用到的菌種包括紅法夫酵母、粘紅酵母[29]、海洋紅酵母（Rhodotorula benthica）[30-31]以及深紅酵母（Rhodotrula glutinis）。

紅法夫酵母是真菌界、真菌門、半知菌亞門、隱球酵母科、紅法夫酵母屬的唯一種，繁殖方式為無性繁殖中的芽殖，代謝方式為有氧呼吸和無氧呼吸兩種，是目前國內外微生物發酵生產蝦青素普遍采用的真菌[32-34]。紅法夫酵母野生株系中蝦青素達細胞干質量的0.05%，一些突變株系中達1.0%，約占總類胡蘿卜素含量的80%。紅法夫酵母生產蝦青素具有如下優勢：可利用多種碳源和氮源生產蝦青素，細胞生長繁殖速度快，可實現高密度培養；生產周期短，成本低；細胞壁容易破碎，生產的蝦青素為右旋構型（3R-3'R），且是游離態，易于人體吸收，提取后酵母菌體可直接作為飼料添加劑[4，35]。

4 酵母蝦青素的生物合成

許多研究表明，甲羥戊酸（mevalonate，MVA）、異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）、法呢基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）、二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallylpyrophosphate，DMAPP）、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）、八氫番茄紅素、四氫番茄紅素、β-胡蘿卜素等是蝦青素的生物合成代謝途徑中的重要中間產物。酵母生物合成蝦青素的途徑分為兩個階段：第一階段為β-胡蘿卜素的合成；第二階段為β-胡蘿卜素通過氧化及羥基化生成蝦青素[36]。酵母中類胡蘿卜素來源于甲羥戊酸途徑，由葡萄糖出發，經糖酵解途徑（embden-meyerhof pathway，EMP）生成丙酮酸，再氧化脫羧得到乙酰輔酶A（Acetyl-CoA），三分子Acetyl-CoA縮合形成MVA，MVA再經磷酸化脫羧轉化成異戊二烯焦磷酸（C5），IPP是所有異戊二烯類化合物（如蝦青素、胡蘿卜素和麥角固醇）的合成前體。IPP經縮合形成GGPP（C20），兩分子GGPP經過二聚作用生成無色的八氫番茄紅素被認為是類胡蘿卜素合成的第一個特異步驟。后續經多步脫氫和一步環化合成β-胡蘿卜素[37]。最終經過兩步酶促反應，利用酮化酶催化β-胡蘿卜素分子上引入2個4位的酮基，羥化酶催化引入2個3位的羥基，將β-胡蘿卜素催化生成蝦青素，酵母蝦青素的合成途徑[4]如下：

5 酵母發酵過程的控制與優化

產蝦青素的酵母具有很強的代謝能力，可以利用單糖[38]、二糖和多糖、有機酸和醇類物質。它還可以迅速利用簡單氮源（如銨、硝酸鹽、尿素或氨基酸）以及復雜混合物（如酵母膏、牛肉膏、麥芽提取物或蛋白胨）。還可以利用工業廢料，可有效降低生產成本，如制糖工藝、玉米濕磨工藝的廢料[39]或木材的酶水解溶液[40]。STOKLOSA R J等[41]利用甜高粱蔗渣（sweet sorghumbagasse，SSB）在2 L發酵罐中培養法夫酵母發酵產生蝦青素65.4 mg/L，占總干細胞蝦青素含量為2.49 mg/g。但是，低成本的培養基可能含有未知的胡蘿卜素生成抑制劑，使其不適用于生產過程[42]。在上述實驗基礎上添加SSB水解液發酵蝦青素含量反而降低至53.3mg/L，這可能是SSB中的酚類化合物起了抑制作用[27，41]。在大多數情況下，培養基必須補充必要的營養成分，還可能包括胡蘿卜素生成的誘導劑或前體[43]。添加一些成分會提高的蝦青素產量，如添加新鮮番茄汁[44]、胡蘿卜汁[45]。

營養物質（碳源、氮源、金屬離子、維生素等）和物理因素（溫度、pH、供氧等）都會影響細胞生長和蝦青素生成。文獻中采用的菌種或蝦青素高產突變菌株的不同，造成培養基組成和發酵工藝條件不盡相同（見表1）。同時，其中的突變菌株含有隨機插入的基因片段，數量或位置以及插入基因的確切功能性質在大多數情況下仍不清楚，從而可能影響文獻之間的可比性。對于營養物質和培養方式對細胞生長和蝦青素產量的影響可以做以下總結。

紅法夫酵母是一種中等嗜冷性酵母、其生長溫度范圍為0～27 ℃。根據所使用的（突變）菌株、蝦青素生產和酵母細胞生長的最佳溫度通常位于18～22 ℃。蝦青素合成和酵母細胞生長的最佳pH值通常介于5～6之間。酵母細胞生長最佳溫度或pH值等培養條件一般情況下與蝦青素合成以及積累的最佳溫度或pH值不同。因此，在發酵過程中改變pH值或溫度均可在發酵培養過程中提高蝦青素產量。無論是突變株還是野生株，培養溫度和培養基pH值對細胞內蝦青素含量、類胡蘿卜素組成都有很強的影響[52-53]。

氧在蝦青素生物合成中起著關鍵作用、蝦青素的積累量與氧的轉移速率有關。氧氣供應不足導致β-胡蘿卜素積累、降低β-胡蘿卜素向蝦青素氧化的效率。因此，充分的氧氣有助于蝦青素的積累[54]。在10%～20%的空氣飽和度下有一個臨界溶解氧濃度，低于此值的溶解氧濃度會抑制細胞生長和類胡蘿卜素的形成。然而，氧氣含量過多會抑制酵母細胞生長。因此，為紅法夫酵母細胞提供適量的氧氣有助于提高蝦青素的合成。所以，在培養不同菌株時需要對菌體耗氧量進行確定從而調節發酵設備的轉速。除了調節轉速、改變空氣流速提高通氧量、向培養基中添加具有高氧溶解度的生物相容性有機溶劑作為氧載體，比如油酸、正十二烷、豆油、Tween-80、乙酸乙酯等、也可以改善細胞的氧轉移速率。

在細胞生長指數期，高糖將會抑制番茄紅素合成β-胡蘿卜素及β-胡蘿卜素合成蝦青素的兩個過程。因此，不宜采用高碳源濃度[54]。但在細胞生長的后期，高碳源濃度可促進胡蘿卜素的積累[55]。因此，可以通過采用分批補料工藝來消除高糖濃度的拮抗作用，同時實現高生物量和高細胞內蝦青素濃度。工業上，紅法夫酵母發酵過程分為兩個階段：細胞生長階段和成熟階段。通過提供一個低的C/N比率（碳源與氮源濃度的比率），細胞最初表現為快速的生長，當接近高的細胞濃度時生長速率逐漸變慢。在這一階段，細胞的生長速度高于蝦青素的形成速度。當細胞接近生長穩定期時，轉換到高碳氮比，蝦青素的合成速率高于細胞的生長速度。在相同發酵時間內，通過對不同菌體發酵階段的碳源濃度和碳氮比進行調控，可同時實現高細胞產量和高蝦青素產量。

所使用的（突變）菌株和培養基決定了實現最大加工生產率的進料控制，并且可以通過幾種方法建立。如基于Monod指數進料、pH-stat控制[40]、DO-stat培養控制或測定碳源的濃度后的脈沖進料（參見表1）。作為補料分批工藝的一種替代方法，可以考慮半連續和連續兩種工藝。評估表1中的數據，脈沖進料和指數進料似乎是較好的進料方法。另一種通過在最初代謝的碳源耗盡后添加緩慢代謝的碳源，如甘油或乙酸來增加成熟階段蝦青素。

表1 產蝦青素酵母的培養基及蝦青素產量Table 1 Medium and astaxanthin yield of astaxanthin-producing yeast

6 不同來源蝦青素的提純方法

6.1 蝦青素的破壁處理方法

蝦青素為胞內產物，一般需經過破壁、提取和純化等步驟才可從酵母菌體中提取。常用的破壁方法有機械法、化學法[56]、酶解法和熱處理等[57]。

機械法是利用機械設備將細胞壁撕裂、通過細胞內滲透壓釋放內含物。主要方式有超聲波破碎法、珠式研磨法、噴霧撞擊破碎法以及高壓均漿法。機械法操作簡便而被廣泛使用、但易引起部分位置溶液溫度過高造成蝦青素損失。

化學法主要有二甲基亞砜法、酸堿加熱法和有機溶劑滲透等。堿提法和酸解法破壁需要消耗大量堿和有機酸、使污水排放量增加、造成環境污染、并且較強的酸堿會對蝦青素造成傷害。采用5.55 mol/L乳酸濃度、30 ℃破碎溫度進行破壁提取可減小對蝦青素的損害，最終提取出的蝦青素和總類胡蘿卜素含量分別為1 294.7 μg/g 和1 516.0 μg/g、蝦青素占總提取物的85.4%[56]。

β-葡聚糖酶、蝸牛酶等能水解細胞壁骨架成分β-葡聚糖、與其它方法相比可更加有效地破壁、且避免蝦青素溢出菌體減少損失。酶法處理條件溫和、對設備的要求低、處理過程對環境造成的污染也較小、提取的蝦青素比其他方法獲得的蝦青素更加穩定。

目前，已經開發出用于提取活性組分的多種現代提取方法、例如脈沖電場（pulsed electric field，PEF）[58]、高壓微流化（high-pressure microfluidisation，HPMF）、離子液體（ionic liquids，ILs）[59]等新興技術。PEF的應用可能通過細胞膜的瞬時透化和細胞區室之間帶電物質的電泳運動而對細胞造成致命性損傷或誘導亞致死應激。已有一些學者研究利用PEF從微藻中提取不同有價值化合物。HPMF是一種新興技術，用于乳狀液的高速沖擊、強剪切、瞬時壓降、高頻振動、氣蝕和超高壓（高達200 MPa）、大分子的改性和生物活性成分的提取。與傳統的高壓均質相比、HPMF具有不同的閥、腔室設計和更高的工作壓力。ILs由松散保持的陽離子和陰離子組成，其特征在于可忽略的蒸氣壓、低熔融溫度、優異的熱穩定性和化學穩定性。此外，其溶解纖維素的容量高、離子液體混合物對小球藻脂質提取的影響小。因此，ILs是一種可用于回收小球藻中脂質和蛋白質的新型細胞破碎技術。比較從雨生紅球藻中提取蝦青素的細胞壁破壞效率的各種技術如PEF、超聲（ultrasound、US）、HPMF、HCl和ILs。結果表明，ILs、HCl和HPMF處理對細胞破壞最有效、蝦青素提取率超過80%、PEF和US對細胞壁的破壞效率較低[60]。與傳統破壁技術相比、PEF、HPMF和ILs等新興破壁技術對蝦青素影響較小，實驗過程中所用溶劑較少、耗時短、節能環保。

6.2 蝦青素的提取方法

蝦青素是脂溶性物質，溶于有機溶劑不溶于水，可利用丙酮、乙醇、甲醇、石油醚等極性有機溶劑進行提取。不同溶劑對南極磷蝦中總類胡蘿卜素提取率影響的結果表明，無水乙醇的提取效果最好，總類胡蘿卜素的提取率達到了73.3%[61]。然而，蝦青素雖溶于有機溶劑但溶解度較低，因此，單一溶劑提取效果有限。黃開森等[62]利用乙酸乙酯和乙醇2∶1混合溶液作為浸提液的酸熱法提取的蝦青素含量顯著高于單一溶液的提取效果。

6.3 蝦青素的純化及檢測方法

在蝦青素的純化方面，主要用到薄層層析法（thin layer chromatography，TLC）和柱層析法，薄層層析法可用于粗提物成分的簡單確定，該方法分離度不高、結果重現性差、易受外界因素干擾、對操作人員的操作過程要求極高、不便于純化后期實驗操作。與其他純化方法相比，柱層析設備低廉、更換固定相和流動相方便，是最常用的純化方法。利用不同固定相和流動相的組合能夠實現一些相對簡單樣品的分離與純化、應用范圍很廣。薄層層析法和柱層析適用于前期的純化過程，后期純化利用制備型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法可使純化效果達98%以上、但制備成本較高。HPLC法不僅可以得到高純度蝦青素，還可以選擇合適的流動相利用C18、C30高效液相色譜柱準確測定蝦青素的含量。在實驗中為了快速測定蝦青素的產生量，通常采用紫外可見分光光度法。

7 結語與展望

蝦青素具有廣闊的開發潛力，在醫藥、化妝品、保健品、飼料添加劑等方面均具有很大的利用價值和發展空間。天然蝦青素和化學合成蝦青素的制備過程都各具有一定缺點。今后，蝦青素微生物法合成研究仍將以開發遺傳性狀穩定的高產菌株、使用低成本的培養原料、探索操作簡便的生產工藝、利用先進、快速、精準的提取純化技術來降低生產成本、提高蝦青素產量及純度為主要內容。