豆芽中4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤的測定方法研究

徐 慧，高 宏，郭芳芳

（江蘇省理化測試中心，江蘇南京210042）

近年來，食品安全問題受到了全球的關注。豆芽是利用豆類為原料制發的一種蔬菜制品，因其營養豐富、味道鮮美、價格低廉［1］，成為廣大消費者喜愛的食品（食材）。豆芽的制發過程區別于農作物的栽培、種植過程，由種子培育出可食用的“芽菜”，而4-氯苯氧乙酸等作為植物生長調節劑，曾在豆芽生產中被廣泛使用，抑制豆芽生根、提高豆芽產量，如市面上銷售的“AB水”、“無根水”等［2］。長期食用非法添加此物的食品，對人體健康會造成一定危害［3］，其中，4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤是導致“毒豆芽”事件的主要成分［4］。因此快速靈敏的4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤檢測方法很有必要。

目前，4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤的測定方法一般是樣品用酸化乙腈提取，提取液經分散固相萃取凈化、濃縮或直接進液相色譜-串聯質譜分析［5-10］，上述方法存在基質干擾強、假陽性率高、回收率低、檢測時間長等問題。本方法采用QuECh?ERS快速前處理技術和三重四級桿復合線性離子阱質譜（Qtrap）特有質譜IDA掃描技術，優化填料配比和色譜質譜條件，在保證良好的靈敏度和重現性的同時實現高選擇性，并有效去除樣品中的假陽性干擾，為豆芽中4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤的快速高效準確測定提供了參考。

1 儀器與試劑

1.1 試驗儀器

SCIEX Qtrap4500液質聯用儀（美國AB公司）：配有噴霧離子源（ESI源）；TGL-15B臺式高速離心機（上海安亭）。

1.2 試驗藥材與試劑

豆芽購于南京某大型菜市場，粉碎后-20℃保存。

6-芐基腺嘌呤100 mg（98.5%），DR；4-氯苯氧乙酸100 mg（98.5%），北京曼哈格生物科技有限公司；乙腈：色譜純，德國默克有限公司；甲酸：色譜純，上海麥克林生化科技有限公司；QuEChERS離心管：含300 mg無水硫酸鎂、100 mg C18、100 mgPSA，博納艾杰爾公司。

2 方法

2.1 標準溶液配制

標準儲備液：精密稱取6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸標準品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為1 mg/mL標準儲備液，-20℃保存。

混合標準中間液A（10μg/mL）：分別精密量取6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸標準儲備液（1 mg/mL）各1 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度均為10μg/mL的混合標準中間液A。

混合標準中間液B（1μg/mL）：精密量取混合標準中間液A（10μg/mL）1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度均為1μg/mL的混合標準中間液B。

基質混合標準工作溶液：分別精密量取混合標準中間液B（1μg/mL）2.5、5.0、10、20、40、100μL，用空白基質提取液定容至1.0 mL，作為基質混合標準工作溶液。濃度依次為2.5、5、10、20、40、100 ng/mL臨用新制。

2.2 樣品處理

準確稱取10.0 g（精確至0.01 g）試樣置于50 mL具塞離心管，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液，高速勻漿2 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g無水乙酸鈉，渦旋混合1 min，以10 000 r/min離心5min使乙腈和水相分層。精密量取上層乙腈溶液4 mL置于QuEChERS離心管中，渦旋混合2 min，以4 000 r/min離心5 min，上清液經0.22μm有機相濾膜過濾后，供高效液相色譜-串聯質譜測定。

2.3 色譜條件

色譜柱：C18柱，100 mm×3.0 mm，粒徑2.7μm。流動相：A為含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈。梯度洗脫：0～1 min：90%A-10%B；1～4 min：2%A-98%B；4～5.5 min：2%A-98%B；5.5～7 min：90%A-10%B。流速：0.3 mL/min。柱溫：35℃。進樣量：5μL。

2.4 質譜條件

4-氯苯氧乙酸離子對184.8>126.7、184.8>110.7，DP 40 V，CE22 V、22 V；6-芐基腺嘌呤離子對224.2>133、224.2>106、224.2>117，DP 80 V，CE31 V、46 V、47 V；均為負離子模式，離子源溫度550℃；離子噴霧電壓：4 500 V；氣簾氣：35 psi；霧化氣和加熱氣55 psi。在多反應監測（MRM）的基礎上建立自動關聯掃描（IDA）并由MRM觸發增強子離子掃描（EPI），指定觸發最強的若干母離子執行EPI，執行動態背景扣除，IDA掃描范圍設置50～260 Da，分段掃描段分別為50～71.518 Da、71.518～122.175 Da、122.175～217.908 Da、217.908～260 Da。

2.5 樣品測定

按照上述色譜條件進樣5μL，外標法定量。

3 結果與分析

3.1 儀器條件適用性

按照優化的色譜條件和質譜條件（2.3、2.4），在4min內實現4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤的良好分離，標準譜圖見圖1～3。

圖1 4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤標準色譜圖Fig.1 Chromatogram of 4-Chlorophenoxyaceticacid and 6-Benzylaminopurine

3.2 方法線性回歸方程

以4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作線性回歸方程，得出4-氯苯氧乙酸線性回歸方程：

其相關系數0.998 2。

6-芐基腺嘌呤線性回歸方程：

其相關系數0.997 9。線性相關系數均達到0.99以上，線性良好。

圖2 6-芐基腺嘌呤質譜圖Fig.2 Mass spectrogramof 6-Benzylaminopurine

圖3 4-氯苯氧乙酸質譜圖Fig.3 Mass spectrogram of 4-Chlorophenoxyaceticacid

3.3 加標回收率和重復性試驗

稱取10.0 g空白豆芽基質樣品，分別作10、20、50μg/kg三個水平的加標，每個水平做三個平行，按1.3試驗方法進行測定，計算回收率和相對標準偏差（RSD），以驗證方法重復性，結果如表1所示：

表1 4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤回收率和RSDTable 1 4-chlorophenoxyaceticacid and 6-benzylaminopurine Recovery and RSD

結果表明，在10、20、50μg/kg三個水平的加標下，回收率為85.1%～92.1%，回收良好，每個水平下三個平行的RSD為0.35%～1.18%，方法重復性良好。

3.4 方法定量限

以基質空白所產生的儀器背景信號的10倍值的相應量定義為定量限。結果顯示4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤定量限均為10μg/kg。圖譜如下所示（圖4）。

圖4 陽性樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of positive sample

3.5 假陽性篩查判斷

一般進行二級質譜時容易有假陽性出現，如圖7-8所示，6-芐基腺嘌呤有檢出，色譜圖出峰時間和二級質譜匹配，于是在MRM基礎上建立IDA并由MRM觸發EPI掃描，執行動態背景扣除，排除假陽性，通過三級譜圖比對，結果顯示確實是假陽性，如圖9所示。

圖5 背景噪音圖Fig.5 The noise spectrogram of background.

圖7 假陽性6-芐基腺嘌呤色譜圖Fig.7 Chromatogramof false positive 6-benzyl adenine.

圖9 6-芐基腺嘌呤標準三級譜圖Fig.9 Spectrumtertiary of standard 6-benzyl adenine.

4 討論與結論

本文建立了液相色譜-串聯質譜法可快速準確測定豆芽中兩種生長調節劑4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤。樣品經過酸性乙腈提取后，采用QuECh?ERS快速前處理技術進行凈化，所采用的QuECh?ERS離心管與傳統的方法［9］相比增加了100 mg PSA，PSA填料比氨基柱具有更強的離子交換能力，同時具備陰離子交換作用與極性相互作用，廣泛用于植物農殘分析樣品的處理，有效降低了樣品基質的干擾，大大提高方法靈敏度。利用Qtrap質譜特有MRM-IDA-EPI掃描模式，對低豐度目標物進行鑒定和定量分析，從而有效降低假陽性的發生、提高方法的準確度；同時用Qtrap質譜特有的抗基質干擾，實驗前處理過程無需濃縮，縮短樣品前處理時間和上機時間。

圖6 定量限圖譜Fig.6 The spectrogram of limit of quantification.

圖8 假陽性6-芐基腺嘌呤三級譜圖Fig.8 Spectrumtertiary of false positive 6-benzyl adenine.

所建立的液相色譜-串聯質譜法操作簡單，靈敏度高，能快速、準確檢測出豆芽中的4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤，線性良好，相關系數均大于0.99，定量限均為10μg/kg，加標添加量10～50μg/kg時，回收率為85.1%～92.1%，RSD為0.35%～1.18%。