滇重樓根際土壤有效性元素與藥材質(zhì)量相關(guān)性分析

陽文武，王 巍，趙順鑫，谷文超，黃小蘭，李紫君，周 濃*

（1.重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶404000；2.重慶市涪陵食品藥品檢驗所，重慶408000；3.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶404120；4.大理大學(xué)藥學(xué)院，大理671000）

滇 重 樓［Paris polyphyllavar.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.］為百合科重樓屬多年生藥用植物，以干燥根莖入藥，具有清熱解毒、止痛消腫、涼肝定驚等功效［1］，同時也具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等多種藥理作用［2-4］。近年來由于藥用需求增多而被大肆采挖，導(dǎo)致其野生資源逐漸枯竭，發(fā)展栽培種植品解決野生資源供應(yīng)不足的問題已迫在眉睫。

根際是土壤與植物根莖相互作用的界面，也是植物體與土壤進行物質(zhì)交換和能量轉(zhuǎn)換的重要節(jié)點，而根際土壤中的有效元素對植物的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用［5-7］。研究表明，根際土壤中有效Mn和有效Cu含量對太白貝母總生物堿的積累具有促進作用，而有效Fe含量與貝母辛含量呈顯著負相關(guān)［8］。沈曉鳳等［9］研究發(fā)現(xiàn)根際土壤中有效元素對丹參有效成分的合成和積累有重要影響，特別是有效N、B及Fe對丹參酮合成積累具有促進作用。目前關(guān)于滇重樓根際土壤有效性元素含量分布特征及與藥材品質(zhì)相關(guān)性分析的報道較少。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，西南地區(qū)野生滇重樓根際土壤有效N平均含量高于栽培品，而有效P、有效K平均含量低于栽培品，且以上3種有效元素與土壤酶活性具有顯著相關(guān)性，對滇重樓根莖中總皂苷、總多糖及總黃酮的累積不具有積極作用［10］。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，對西南地區(qū)不同產(chǎn)地滇重樓根際土壤中的有效Mn、Fe、Cu、Zn、Ca、Mg、B等元素進行研究，比較野生品與栽培品含量的差異性及其分布規(guī)律，并對有效性元素與其活性成分進行相關(guān)性分析，探究元素有效性對滇重樓入藥品質(zhì)影響規(guī)律，為滇重樓的科學(xué)化栽培種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

EXPEC 7000型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（杭州聚光科技股份有限公司），UV-2450型紫外可見分光光度計（日本島津集團），ZD-85型氣浴恒溫震蕩器（江蘇省金壇市精達儀器制造有限公司），HDL-4型離心機（江蘇省金壇市鴻科儀器廠），C-MAGHP4型數(shù)顯加熱板（德國IKA公司）。

1.2 樣品與試藥

27份滇重樓樣品采集于云南、貴州、四川3個省份，樣品詳細信息見表1，其中野生品11份、栽培品16份。為保證實驗結(jié)果的準確性和一致性，每個采集地使用對角線法（栽培品）或多點法（野生品）收集滇重樓藥材10～15株，去掉地表枯枝落葉層，運用木鏟輕輕挖掉表面的浮土，采用抖根法收集根際土壤，每個土壤樣本平行采集3份，將其混勻用四分法取樣保留約1 kg的根際土壤［11］。采集藥材及須根于45℃烘箱烘干，粉碎，過100目篩。根際土壤樣品風(fēng)干，研磨，過100目篩。

表1 樣品來源Table 1 Sample sources

元素標準溶液（1 000μg·mL-1）：鎂（Mg，批號：GSB04-1735-2004）、鈣（Ca，批 號：GSB04-1720-2004）、鐵（Fe，批號：GSB04-1726-2004）、銅（Cu，批號：GSB04-1725-2004）、鋅（Zn，批號：GSB04-1761-2004）、錳（Mn，批號：GSB04-1736-2004）、硼（B，批號：GSB04-1716-2004）均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；乙酸銨、氯化鍶、鉻藍K、萘酚綠B、硝酸、二乙三胺五乙酸（DTPA）、氯化鈣、三乙醇胺（TEA）、無水碳酸鈉、無水乙醇、95%乙醇、姜黃素、草酸、氨水均為國產(chǎn)分析純，實驗用水為去離子超純水。

1.3 測定方法

有效Zn、Mn、Fe、Cu利用DTPA浸提，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定［12］；有效Ca、Mg利用乙酸銨溶液浸提，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定［13］；有效B利用沸水浸提-姜黃素比色，采用紫外可見分光光度計測定［14］。

1.4 有效成分含量測定

采用超高效液相色譜法測定，具體見課題組報道［15］。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用SPSS 20.0軟件進行相關(guān)性分析、聚類分析和回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇重樓根際土壤有效元素含量

不同產(chǎn)地滇重樓根際土壤有效元素含量結(jié)果見表2，部分存在顯著性差異（P<0.05）。滇重樓野生品根際土壤有效Mn的含量為23.027～146.907 mg·kg-1，平均值為83.963 mg·kg-1；栽培品根際土壤有效Mn的含量為8.909～62.073 mg·kg-1，平均值為31.460 mg·kg-1。整體上看，野生品根際土壤有效Mn的含量高于栽培品。

表2 滇重樓根際土壤有效元素含量Table 2 Effective element content of rhizosphere soil of P.polyphylla var.yunnanensis±s,n=3

表2 滇重樓根際土壤有效元素含量Table 2 Effective element content of rhizosphere soil of P.polyphylla var.yunnanensis±s,n=3

注：同列不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。

NO.Yt-1 Yt-2 Yt-3 Yt-4 Yt-5 Yt-6 Yt-7 Yt-8 Yt-9 Yt-10 Yt-11均值CV（%）Zt-1 Zt-2 Zt-3 Zt-4 Zt-5 Zt-6 Zt-7 Zt-8 Zt-9 Zt-10 Zt-11 Zt-12 Zt-13 Zt-14 Zt-15 Zt-16均值CV（%）Mn（mg·kg-1）107.257±0.943c 76.406±0.631f 81.888±1.200e 77.250±0.649f 23.027±0.185j 134.691±2.068b 66.718±0.988g 58.440±0.523i 146.907±1.459a 89.308±0.902d 61.697±0.269h 83.963 41.89 28.193±0.484fg 30.646±0.304e 27.150±1.064g 40.952±0.355c 28.913±1.354f 8.909±0.136l 28.012±0.377fg 58.548±0.568b 25.222±0.247h 9.752±0.102l 15.256±0.140k 34.771±0.327d 62.073±0.779a 22.643±0.157i 20.856±0.307j 61.457±0.508a 31.460 53.14 Fe（mg·kg-1）42.077±0.855a 17.365±0.262g 38.224±0.713b 36.156±0.474c 17.955±0.409g 31.501±0.376e 11.547±0.100h 36.003±0.394c 12.219±0.401h 19.993±0.376f 33.911±0.746d 26.996 41.70 35.682±0.924b 6.169±0.124k 3.990±0.085l 10.850±0.243i 4.329±0.089l 5.566±0.006k 2.640±0.048m 28.800±0.573d 20.941±0.296g 38.032±0.407a 24.690±0.338e 31.989±0.593c 8.698±0.318j 28.119±0.392d 22.762±0.054f 16.133±0.230h 18.087 67.86 Cu（mg·kg-1）0.311±0.212g 0.695±0.012f 0.710±0.027f 1.383±0.037d 3.244±0.079a 1.868±0.042b 1.691±0.026c 1.383±0.032d 0.766±0.013f 0.073±0.002h 1.187±0.030e 1.210 72.42 5.530±0.184a 2.700±0.091d 0.581±0.007k 4.878±0.307b 0.069±0.001l 0.862±0.019ij 0.701±0.016jk 3.292±0.076c 1.010±0.025i 1.606±0.038fg 0.098±0.001l 1.241±0.020h 1.744±0.010f 2.184±0.059e 1.524±0.020g 1.770±0.021f 1.862 84.39 Zn（mg·kg-1）1.073±0.025h 8.013±0.214a 3.426±0.077c 1.449±0.028g 7.259±0.110b 2.116±0.035e 1.104±0.028h 2.826±0.055d 1.827±0.029f 0.393±0.173i 0.234±0.078i 2.702 97.11 5.738±0.141f 12.304±0.293b 3.037±0.050hi 2.749±0.098i 0.090±0.001m 0.714±0.016l 2.830±0.029i 7.028±0.181e 3.307±0.082h 1.317±0.014k 0.849±0.003l 9.874±0.145c 5.009±0.083g 8.954±0.164d 2.063±0.039j 24.476±0.423a 5.646 109.03 Mg（cmol·kg-1）1.146±0.022k 10.250±0.040a 4.867±0.119c 1.811±0.045h 7.411±0.072b 3.376±0.049e 1.442±0.023j 2.417±0.036g 4.310±0.018d 2.715±0.024f 1.549±0.010i 3.754 75.78 2.095±0.041jk 6.327±0.227a 1.366±0.031l 4.234±0.063e 2.172±0.064j 1.016±0.026m 3.134±0.094h 2.978±0.080h 5.525±0.099c 1.931±0.049k 1.930±0.047k 3.365±0.082g 5.037±0.134d 5.932±0.141b 2.419±0.048i 3.633±0.122f 3.318 50.06 Ca（cmol·kg-1）15.882±0.767f 58.958±1.242b 18.098±0.646e 6.751±0.483i 62.303±1.617a 12.627±0.371g 10.065±0.438h 16.124±0.449f 48.558±0.753c 4.820±0.342j 46.074±0.800d 27.296 80.36 77.843±2.267a 51.748±2.036c 17.341±0.655i 19.845±0.743hi 7.733±0.493k 21.086±0.697h 75.651±1.719a 32.268±1.228f 24.292±1.024g 5.435±0.781kl 4.347±0.806l 14.199±0.346j 30.804±0.973f 36.645±1.575e 48.321±1.762d 60.472±1.815b 33.002 71.70 B（mg·kg-1）0.317±0.011c 0.146±0.006g 0.522±0.018a 0.291±0.007d 0.185±0.027f 0.280±0.011d 0.252±0.004e 0.274±0.006de 0.402±0.006b 0.191±0.015f 0.177±0.006f 0.276 39.87 0.157±0.009f 0.443±0.013d 0.161±0.013f 0.878±0.012b 0.439±0.006d 0.159±0.006f 1.274±0.022a 0.492±0.004c 0.496±0.009c 0.142±0.013f 0.362±0.062e 0.157±0.009f 0.470±0.006cd 0.161±0.013f 0.435±0.009d 1.301±0.009a 0.470 79.79

滇重樓野生品根際土壤有效Fe的含量為11.547～42.077 mg·kg-1，平均值為26.996 mg·kg-1；栽培品根際土壤有效Fe的含量為3.990～38.032 mg·kg-1，平均值為18.087 mg·kg-1。整體上看，野生品根際土壤有效Fe的含量高于栽培品。

滇重樓野生品根際土壤有效Cu的含量為0.073～3.244 mg·kg-1，平均值為1.210 mg·kg-1；栽培品根際土壤有效Cu的含量為0.069～5.530 mg·kg-1，平均值為1.862 mg·kg-1。整體上看，栽培品根際土壤有效Cu的含量高于野生品。

滇重樓野生品根際土壤有效Zn的含量為0.234～8.013 mg·kg-1，平均值為2.702 mg·kg-1；栽培品根際土壤有效Zn的含量為0.090～24.476 mg·kg-1，平均值為5.646 mg·kg-1。整體上看，栽培品根際土壤有效Zn的含量高于野生品。

滇重樓野生品根際土壤有效Mg的含量為1.146～10.250 cmol·kg-1，平 均 值 為3.754 cmol·kg-1；栽培品根際土壤有效Mg的含量為1.016～6.327cmol·kg-1，平均值為3.318 cmol·kg-1。整體上看，野生品根際土壤有效Mg的含量高于栽培品。

滇重樓野生品根際土壤有效Ca的含量為4.820～62.303 cmol·kg-1，平均值為27.296 cmol·kg-1；栽培品根際土壤有效Ca的含量為4.347～77.843cmol·kg-1，平均值為33.002 cmol·kg-1。整體上看，栽培品根際土壤有效Ca的含量高于野生品。

滇重樓野生品根際土壤有效B的含量為0.146～0.522 mg·kg-1，平均值為0.276 mg·kg-1；栽培品根際土壤有效B的含量為0.142～1.301 mg·kg-1，平均值為0.470 mg·kg-1。整體上看，栽培品根際土壤有效B的含量高于野生品。

總的來看，滇重樓野生品根際土壤中的有效Mn、Fe、Mg高于栽培品，而有效Cu、Zn、Ca、B低于栽培品。野生品中，Yt-2產(chǎn)地有效Zn、Mg含量較高；Yt-5產(chǎn)地有效Cu、Ca含量較高；Yt-1、Yt-3、Yt-9分別以有效Fe、B、Mn含量為最高。此外，野生產(chǎn)地中，有效Zn和有效Ca的變異系數(shù)較大，分別達97.11%和80.36%，表明有效Zn和Ca在野生產(chǎn)地中離散程度較大。栽培品中，Zt-1產(chǎn)地有效Cu、Ca含量較高；Zt-16產(chǎn)地有效Zn、B含量較高；Zt-2、Zt-10、Zt-13等產(chǎn)地分別以有效Mg、Fe、Mn含量為最高。其中栽培產(chǎn)地的有效Zn和有效Cu的變異系數(shù)較大，分別達109.03%和84.39%，表明有效Zn和Cu在栽培產(chǎn)地中離散程度較大。

2.2 相關(guān)性分析

重樓皂苷是滇重樓最重要的化學(xué)成分，課題組前期已對同一批滇重樓樣品的9種甾體皂苷含量進行了測定分析［15］，結(jié)合前期研究數(shù)據(jù)，利用SPSS軟件分別對土壤有效元素之間及有效元素與重樓皂苷之間進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3-4。由表3可知，有效Cu與有效Ca之間呈顯著正相關(guān)（r=0.406，P<0.05）；有效Zn與有效Mg、Ca、B之間均呈顯著正相關(guān)（r=0.430、0.477、0.417，P<0.05）；有效Ca與有效Mg之間呈顯著正相關(guān)（r=0.434，P<0.05），表明各土壤有效元素之間表現(xiàn)協(xié)同作用。由表4可知，有效Mn與纖細薯蕷皂苷呈顯著負相關(guān)（r=-0.400，P<0.05）；有效B與重樓皂苷I、V之間均呈顯著負相關(guān)（r=-0.413、-0.446，P<0.05），表明土壤有效元素含量對滇重樓品質(zhì)有一定影響，過多的有效Mn和有效B含量不利于重樓皂苷積累。

表3 滇重樓根際土壤有效元素相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of available elements in rhizo?sphere soil of P.polyphylla var.yunnanensis

表4 滇重樓根際土壤有效元素與重樓皂苷相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between effective elements and polyphylla saponins in rhizosphere soil of P.polyphylla var.yunnanensis

2.3 聚類分析

利用SPSS軟件分別對不同產(chǎn)地滇重樓根際土壤有效元素進行聚類分析，見圖1。當歐式距離為15時，滇重樓產(chǎn)地被分成4大類，其中Zt-7、Zt-16為I類；Zt-1單獨為II類；Yt-2、Yt-9為III類；剩余產(chǎn)地為IV類。結(jié)果表明，栽培產(chǎn)地根際土壤有效元素含量整體略高于野生產(chǎn)地。

圖1 滇重樓根際土壤有效元素聚類分析Fig.1 Cluster analysisof available elements in rhizosphere soil of P.polyphylla var.yunnanensis

2.4 滇重樓根際土壤有效元素與滇重樓質(zhì)量的回歸分析

為了更加準確的找出影響滇重樓重樓皂苷的重要有效性元素，對所有產(chǎn)地的滇重樓根際土壤有效性元素與重樓皂苷進行逐步回歸分析［9］，模型中設(shè)置α=0.05的檢驗水準。采用穩(wěn)健逐步回歸分析得到以下回歸方程：

纖細薯蕷皂苷=0.666-0.005 Mn

重樓皂苷I=9.638-6.037 B

重樓皂苷V=0.707-0.499 B

結(jié)果表明，滇重樓根際土壤有效Mn主要影響纖細薯蕷皂苷的含量；有效B主要影響重樓皂苷I、V的含量，與相關(guān)性分析結(jié)果一致。

3 討論

藥材植物的健康生長離不開其根際土壤中的微量元素，有效的微量元素可以直接被植物吸收［16］，參與植物的各種理化反應(yīng)。同時，根際土壤中有效元素含量的高低也間接反映了土壤肥力的狀況。Fe、Mn、Zn、Cu、B是中藥材植物體內(nèi)重要的微量元素。研究發(fā)現(xiàn)，缺Fe會引起植物出現(xiàn)黃葉病，缺Mn則會導(dǎo)致現(xiàn)黃斑癥，而缺B則使植物花而不實，缺Zn可能導(dǎo)致小葉病的發(fā)生［17］。本研究結(jié)果表明，野生品中云南省保山市（Yt-9）有效元素含量總量最高，其中有效Mn含量最為豐富，是野生產(chǎn)地均值的1.75倍；云南省易門縣（Yt-7）有效元素含量最為貧瘠，除有效Cu外，其他有效元素含量均低于均值。而栽培品中，云南省劍川縣（Zt-16）有效元素含量總量最高，其中有效Mn、Zn、Mg、Ca、B等元素含量均高于栽培產(chǎn)地均值；云南省易門縣（Zt-6）有效元素含量最為貧瘠，所有有效元素含量均低于均值。可以看出，云南產(chǎn)地的滇重樓根際土壤有效元素含量差異性最大，其中易門縣產(chǎn)地的野生與栽培滇重樓根際土壤有效元素含量均較低，造成這種狀況的原因可能與當?shù)氐膒H有關(guān)。前期研究表明，云南省易門縣滇重樓的根際土壤pH為7.22～7.24［10］，呈弱堿性，而土壤中的Fe、Cu等元素易生成氫氧化物沉淀而被固定［18］。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)土壤有效B和Mn與pH呈顯著負相關(guān)［19-21］，因此易門縣產(chǎn)地土壤的有效元素含量較低。同時，不同滇重樓產(chǎn)地根際土壤有效元素含量的差異性也可能與其群落結(jié)構(gòu)和微生物種類有關(guān)［22-23］，對于有效元素含量較低的產(chǎn)地，應(yīng)根據(jù)所在地的實際情況制定適當?shù)氖┓史桨福a充所缺微量元素，以保證滇重樓根際土壤有效元素的豐富度。

相關(guān)性分析和回歸分析表明，滇重樓根莖中的纖細薯蕷皂苷與其根際土壤有效Mn呈顯著負相關(guān)，根莖中的重樓皂苷I、V均與其根際土壤有效B呈顯著負相關(guān)，說明根際土壤中的有效Mn和B含量過高不利于重樓皂苷積累。因此，在種植滇重樓時，應(yīng)適當降低含Mn和B的微肥，以保證滇重樓根莖的入藥品質(zhì)。此外，滇重樓根際土壤各有效元素之間呈顯著的正相關(guān)，其中有效Cu與有效Ca之間，有效Zn與有效Mg、Ca、B之間，有效Ca與有效Mg之間均存在正相關(guān)性，說明土壤中各有效性元素之間具有協(xié)同的作用，與前期研究結(jié)果一致［10］。

綜上，不同產(chǎn)地滇重樓根際土壤有效元素含量差異性較大，野生產(chǎn)地根際土壤中的有效Mn、Fe、Mg高于栽培產(chǎn)地，而栽培產(chǎn)地根際土壤中的有效Cu、Zn、Ca、B高于野生產(chǎn)地。根際土壤有效元素與其根莖品質(zhì)具有一定相關(guān)性，特別是有效Mn和有效B元素，對部分重樓皂苷的累積具有拮抗作用。因此，明確土壤中各有效性元素含量的分布規(guī)律，有利于了解土壤中有效性元素的豐缺狀況，從而制定合理的施肥計劃，為滇重樓的科學(xué)化種植提供參考。