多重PCR法檢測5種動物源性成分的適用性驗證

馬慧娟，高 宏，牛鵬飛，梅 嬋

(江蘇省理化測試中心，江蘇南京 210042)

應用PCR方法檢測食品中動物源性成分的研究和標準有很多，目前已頒布的國家標準、行業標準和地方標準主要是基于常規定性PCR法和實時熒光PCR法對單一動物源性成分的定性檢測。在實際工作中，對于動物源性成分不明確的加工制品，在需明確其成分時，需要通過不同的方法進行多次檢測才能確定結果，其周期長、工作量大、成本高。在未來的動物源成分檢測中，基于常規定性PCR法的檢測技術已經越來越不能滿足多種動物源性制品的鑒定需求，因此建立多重PCR法提高檢測的效率與通量對肉類食品安全的及時監管十分重要[1]。本研究通過對新建立的一種檢測動物源性食品中豬、牛、羊、雞和鴨成分的多重PCR法進行混合肉樣檢測，驗證其方法的適用性和可行性，并用建立的多重PCR檢測方法和單一PCR檢測方法對市售的20種動物源性食品分別進行檢測，驗證多重PCR法鑒別豬、牛、羊、雞和鴨成分可行性。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

鮮肉（豬、牛、羊、鴨、雞）購自南京某大型菜市場，-20 ℃保存。加工肉制品（鴨血、牛肉卷、雞肉火腿腸、午餐肉罐頭等）購自南京某菜市場、超市或火鍋食材店。

DNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0、10×PCR Buffer（Mg2+plus）、dNTP Mixture（各2.5 mmol·L-1）、TaKaRa Taq（5 U/μL）、瓊脂糖（50 g），均購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器和設備

ABI 2720普通PCR儀，購自美國賽默飛；EPS 300電泳儀，購自Tanon；Universal GenoSens1800凝膠成像儀，購自上海勤翔。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本DNA提取及質量檢測

樣本DNA的提取方法按照DNA提取試劑盒的說明書方法步驟進行。樣本DNA提取后取DNA溶液1 μL，滴加到超微量紫外分光光度計中，測定DNA的質量濃度及純度。DNA濃度控制在50～100 ng/μL，OD260nm/OD280nm值為1.8～2.1。

1.3.2 多重PCR方法檢測混合樣品

用所建立的方法對混合肉樣進行PCR擴增，反應時加入2種、3種、4種、5種肉樣的混合模板，按優化的引物濃度配比進行多重PCR檢測，通過多次實驗優化模板混合比例，以達到1個PCR反應和1次電泳可同時擴增出2～5條特異性條帶，達到鑒別2～5種動物源性成分的目的。

1.3.3 市售動物源性食品檢測

對從超市、菜市場和門店隨機購買的20種肉制品，用建立的多重PCR檢測方法和檢測豬、牛、羊、雞和鴨的行業標準[2-4]分別對豬、牛、羊、雞和鴨5種成分進行檢測，以檢驗建立的方法能否成功應用于市售肉類食品中的動物源性成分，進一步驗證此方法的可行性。市售樣品的DNA提取也同樣按1.3.1的方法進行。

2 結果與分析

2.1 DNA質量濃度和純度的檢測結果

按照1.3.1對提取的樣品DNA進行質量濃度及純度測定，結果見表3。

由表1看出，用微量核酸蛋白測定分析儀檢測提取的樣品DNA的濃度和純度，所測OD260nm/OD280nm值在1.8～2.1，有的DNA濃度提取的較高，需要對所提DNA的濃度進行適當稀釋，從樣品中提取的DNA無論是濃度還是純度，均能滿足后續PCR擴增實驗的需求。

表1 DNA的質量濃度及純度

2.2 混合肉樣品檢測結果

分別以豬、牛、羊、雞和鴨2種、3種、4種及5種肉樣混合為混合模板，用建立的多重PCR檢測方法進行多重PCR檢測。結果見圖1和圖2。

由圖1可以看出，當豬和牛、豬和羊、豬和雞、豬和鴨模板混合比例分別為1︰1、1︰1、1︰2、1︰2時，牛和羊、牛和雞、牛和鴨模板混合比例分別為1︰1、1︰2、1︰2時，羊和雞、羊和鴨、鴨和雞模板混合比例分別為1︰2、1︰2、1︰1時，豬、牛和羊、豬、牛和雞、豬、牛和鴨、豬、羊和雞、豬、羊和鴨、豬、雞和鴨、牛、羊和雞、牛、羊和鴨、牛、雞和鴨、羊、雞和鴨模板混合比例分別為1︰1︰1、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰2︰2、1︰1︰2、1︰1︰2、1︰2︰2、1︰2︰2時，能分別同時擴增出牛274 bp，羊331 bp，398 bp，雞227 bp，鴨201 bp 2條或3條特異性條帶。

圖1 混合肉樣檢測結果（2種、3種肉樣混合）

由圖2可以看出，當豬、羊、牛和雞、豬、羊、牛和鴨、豬、牛、雞和鴨、豬、羊、雞和鴨、牛、羊、雞和鴨模板混合比例分別為1︰1︰1︰2、1︰1︰1︰2、1︰1︰2︰2、1︰1︰2︰2、1︰1︰2︰2時，豬、牛、羊、雞和鴨模板混合比例1︰1︰1︰2︰2時，能分別同時擴增出牛274 bp，羊331 bp，398 bp，雞227 bp，鴨201 bp 4條或5條特異性條帶。以上的電泳條帶清晰，亮度基本一樣，能分別有效鑒別出2種、3種、4種或5種動物源性成分。

圖2 混合肉樣檢測結果（4種、5種肉樣混合）

2.3 市售肉制品檢測結果

對市售的20種肉制品進行DNA提取，應用建立的多重PCR方法和單一PCR分別進行檢測，判斷所檢測成分與所貼標簽是否相符，同時驗證所建立方法的可行性和實用性。擴增結果見表2。

由表2看出，應用建立的五重PCR方法與用單一PCR對市售的20種肉制品分別進行豬、牛、羊、雞和鴨成分進行檢測，由檢測結果對比可以看出，兩種方法檢測出的動物源性成分結果一致。使用混合引物對上述5種成分進行檢測，檢測結果能夠擴增出來相應的多種肉的特異性條帶，該檢測方法能夠準確地鑒定出所建立方法的5種常見動物成分，對于經過加工的肉制品，方法擴增出來的條帶依然很清晰有效。本研究所鑒定的產品大多數與標簽標識成分相符，但也存在造假和摻假的問題，所購買的樣品摻假和造假率 為25%。

表2 市售20種肉制品檢測結果

3 討論

本研究建立的多重PCR法可滿足一次PCR反應和一次電泳就能分別有效鑒別出2種、3種、4種或5種動物源性成分，大大地減少了試劑和時間成本。為驗證所建立方法的可行性和準確性，對市售的20種肉制品應用所建立的五重PCR和單一PCR對樣品分別進行豬、牛、羊、雞和鴨成分的檢測，檢測結果表明所建立的方法與單一PCR檢測結果一致。表明所建立的多重PCR法可同時檢測豬、牛、羊、雞和鴨5種動物源性成分。本研究與王金斌等[1]研究的5種動物源性成分多重PCR檢測方法相比，開發的方法引物數量少3條，與其相比，本研究使用的試劑更少，更加節約時間和成本。