高效液相色譜儀、酶標(biāo)儀和快檢儀檢測(cè) 小麥中嘔吐毒素的對(duì)比分析

陳 舟

（襄陽(yáng)市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北襄陽(yáng) 441000）

嘔吐毒素，又名為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生，是一種全球性的污染谷物的霉菌毒素之一，通常在小麥、大麥、燕麥、玉米等谷物及其制品中最為常見(jiàn)。DON超標(biāo)攝入會(huì)導(dǎo)致人畜厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)和反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致組織壞死和內(nèi)臟出血，甚至死亡[1]。正因?yàn)镈ON對(duì)人類(lèi)的生命健康有很大的威脅，我國(guó)對(duì)小麥中的DON含量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。

當(dāng)前，我國(guó)檢測(cè)機(jī)構(gòu)針對(duì)小麥中的DON檢測(cè)設(shè)備有很多種，但涉及檢測(cè)原理主要有串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、薄層色譜測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法、膠體金紙層析免疫法等。在DON檢測(cè)中根據(jù)不同的需求，選擇不同的設(shè)備和方法來(lái)檢測(cè)，對(duì)于檢測(cè)效率至關(guān)重要，因此，本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)高效液相色譜儀、酶標(biāo)儀、真菌毒素快速檢測(cè)儀3種設(shè)備檢測(cè)小麥中DON的優(yōu)劣進(jìn)行對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測(cè)器，島津；Model-680酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂(lè)；ROSA-M快檢儀，美國(guó)CHARM；TLE204E/02電子天平，梅特勒-托利多；PHC-11D氮吹儀，月旭科技（上海）；HY-4振蕩器，金壇市大地自動(dòng)化儀器；800D離心機(jī)，常州普天儀器；DON免疫親和柱，安譜（CNW）；Deoxynivalenol標(biāo)準(zhǔn)品，安譜（ANPEL）；DON檢測(cè)試劑盒，芬德生物（SZ FINDE）；ROSA DON快檢試劑條，美國(guó)CHARM。

DON質(zhì)控樣-1、DON質(zhì)控樣-2，國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院；甲醇（色譜純）；聚乙二醇（生化試劑）；氯化鈉（分析純）；磷酸氫二鈉（分析純）；磷酸二氫鉀（分析純）；氯化鉀（分析純）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純）；去離子水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 高效液相色譜儀

稱(chēng)取25 g樣品于100 mL具塞三角瓶，加5 g聚乙二醇，加水100 mL，混勻，振蕩20 min。以玻璃纖維濾紙過(guò)濾至澄清，移取濾液2.0 mL，以1滴/s流速過(guò)免疫親和柱，再分別用5 mL PBS緩沖鹽溶液和水先后淋洗，棄去流出液，抽干小柱。加2 mL甲醇洗脫親和柱，下滴速度1滴/s，收集洗脫液，50 ℃下氮?dú)饩従彺抵两桑詈蠹尤?.0 mL初始流動(dòng)相，渦旋30 s溶解，0.45 μm濾膜過(guò)濾，取濾液入進(jìn)樣小瓶待上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 酶標(biāo)儀

稱(chēng)取5.0 g粉碎樣品于50 mL離心管，加入20 mL去離子水，振蕩5 min，室溫4 000 r/min離心10 min；靜置分層，取0.1 mL上清液，加入0.9 mL復(fù)溶液，混勻，待測(cè)。

1.2.3 DON快速檢測(cè)儀

準(zhǔn)確稱(chēng)量5.0 g粉碎樣品于50 mL的離心管，加入25 mL 的去離子水，渦旋振蕩1 min，靜置1 min，取1 000 μL上清液于1號(hào)離心管中，放入離心機(jī)5 000 r/ min，離心1 min后，從中取100 μL樣品提取液和1 000 μL嘔吐毒素稀釋緩沖液（DONQ）放入2號(hào)離心管，渦旋振蕩10 s，待測(cè)。

1.3 上機(jī)檢測(cè)

1.3.1 高效液相色譜儀

高效液相色譜儀設(shè)置紫外檢測(cè)器，色譜柱：XB-C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm），其余色譜條件參考GB 5009.111—2016[2]。

1.3.2 酶標(biāo)儀

加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品50 μL/孔到對(duì)應(yīng)微孔中，然后加抗體工作液50 μL/孔，輕輕震蕩5 s混勻，37 ℃避光反應(yīng)30 min。 洗板：甩干孔中液體，用工作洗滌液350 μL/孔充分洗滌5次，每次間隔30 s，最后用吸水紙拍干。加酶標(biāo)記物 100 μL/孔，37 ℃避光反應(yīng)30 min。再次洗板（同上）。顯色：加底物A 50 μL/孔，再加底物B 50 μL/孔，輕輕振蕩5 min混勻，37 ℃避光顯色15 min。終止：加入終止液50 μL/孔， 輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀于450 nm（建議雙波長(zhǎng)450/630 nm）處上機(jī)測(cè)定每孔OD值。

1.3.3 DON快速檢測(cè)儀

讀數(shù)儀調(diào)至DON-00檔。取嘔吐毒素快檢試劑條（綠色），將其反面放入孵育器中，膠紙撕開(kāi)至黑線處，取300 μL待測(cè)稀釋液，緩慢加入試劑條凹槽中后蓋上膠紙，45 ℃下孵育5 min后，插入讀數(shù)儀測(cè)定讀數(shù)。

1.4 儀器檢測(cè)原理對(duì)比

（1）高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器）。利用物質(zhì)在色譜柱流動(dòng)相與固定相之間有不同的分配量，進(jìn)行DON分離，不同濃度的DON在紫外檢測(cè)器引起不同響應(yīng)值進(jìn)而輸出不同峰形，最后用外標(biāo)法定量。

（2）酶標(biāo)儀篩查原理。基于抗原抗體間接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)技術(shù)，DON和酶標(biāo)板上的預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗嘔吐毒素抗體，標(biāo)記后用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含DON量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較后得出具體值。

（3）DON快檢測(cè)試儀檢測(cè)原理。基于膠體金免疫層析技術(shù)，以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，根據(jù)膠體金本身的顯色特點(diǎn)來(lái)診斷特異性的待測(cè)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 回收率與精密度、質(zhì)控樣精準(zhǔn)度試驗(yàn)

在空白小麥樣品中分別加入3組不同濃度的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照正常試驗(yàn)步驟進(jìn)行前處理和檢測(cè)，每個(gè)加標(biāo)樣品重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)定其回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，3種設(shè)備檢測(cè)方法的回收率和精密度均達(dá)標(biāo)[3]。在低濃度檢測(cè)時(shí)高效液相色譜儀回收率略顯偏低，可能由于其方法前處理相對(duì)復(fù)雜，造成一定的DON損失。精密度方面，高效液相色譜儀精密度最高，穩(wěn)定性最好。

表1 小麥樣品中DON加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差試驗(yàn)結(jié)果

將兩個(gè)不同濃度DON質(zhì)控樣，按照正常試驗(yàn)步驟進(jìn)行前處理和檢測(cè)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行樣，測(cè)定其準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可知高效液相色譜儀準(zhǔn)確度最高，其次是酶標(biāo)儀，快檢儀準(zhǔn)確度略顯不足，尤其是高濃度檢測(cè)時(shí)更明顯。由于快檢儀檢測(cè)原理和膠體金紙?jiān)噭l制備工藝等原因，快檢儀不適合做定量檢測(cè)。另外經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)得出，酶標(biāo)儀在高通量樣品檢測(cè)時(shí)，由于抗體的交叉反應(yīng)、稀釋倍數(shù)及操作污染等因素影響，有出假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)，故陽(yáng)性試樣需進(jìn)一步驗(yàn)證[4]。

表2 三種設(shè)備測(cè)定小麥質(zhì)控樣品中DON含量試驗(yàn)結(jié)

2.2 3種設(shè)備的操作使用對(duì)比

對(duì)3種設(shè)備在單位樣品檢驗(yàn)時(shí)間、費(fèi)用、操作等方面進(jìn)行綜合比較，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可知，3種檢測(cè)設(shè)備各有優(yōu)劣，檢測(cè)機(jī)構(gòu)、企業(yè)或者檢驗(yàn)人員可根據(jù)自身不同需求和環(huán)境、樣品量等因素綜合考量來(lái)選擇最合適的設(shè)備進(jìn)行檢驗(yàn)。尤其是快檢儀操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，適合于樣品的快速篩查，可滿(mǎn)足我國(guó)糧食及飼料企業(yè)、政府職能監(jiān)管部門(mén)等開(kāi)展日常現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)和監(jiān)管抽查工作[5]。

表3 3種設(shè)備檢測(cè)綜合比較

3 結(jié)論

本文主要對(duì)高效液相色譜儀、酶標(biāo)儀、真菌毒素快速檢測(cè)儀檢測(cè)小麥中嘔吐毒素的操作過(guò)程和檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

從操作過(guò)程看，高效液相色譜儀前處理最為復(fù)雜和關(guān)鍵，直接影響結(jié)果準(zhǔn)確度，另外消耗試劑較多，易造成污染，主要操作為電腦軟件，能自動(dòng)連續(xù)處理樣品，可用于科研和高質(zhì)量檢驗(yàn)，對(duì)人員能力有一定要求；酶標(biāo)儀操作過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，所需耗材成本也較低，但因其配置試劑較多，操作暴露風(fēng)險(xiǎn)較大，有一定安全隱患，但能同時(shí)上機(jī)檢測(cè)96個(gè)樣品，單批次平均成本低，也可用于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，人員操作易上手；快檢儀操作最為簡(jiǎn)單，所用耗材也較少，檢測(cè)過(guò)程比較安全，檢測(cè)速度較快，人員水平要求較低。

從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，3種設(shè)備回收率和精密度均符合要求，其中高效液相色譜儀精密度和準(zhǔn)確度最高；酶標(biāo)儀檢測(cè)可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此在其檢測(cè)出陽(yáng)性樣品時(shí)，可用高效液相色譜儀進(jìn)行復(fù)檢確認(rèn)；快速檢測(cè)儀檢測(cè)速度較快，但其定量檢測(cè)準(zhǔn)確度不高，比較適用于快速定性檢測(cè)。

在實(shí)際應(yīng)用中，3種設(shè)備可以相互配合使用，靈活運(yùn)用各種設(shè)備優(yōu)勢(shì)來(lái)高效率完成工作。糧食企業(yè)單位在新糧收購(gòu)、轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)可運(yùn)用快速檢測(cè)儀進(jìn)行糧食DON指標(biāo)快速篩查，檢測(cè)機(jī)構(gòu)在集中進(jìn)行糧食品質(zhì)分析時(shí)，可運(yùn)用酶標(biāo)儀進(jìn)行高通量檢測(cè)[6]，對(duì)以上兩個(gè)設(shè)備篩檢出的陽(yáng)性批次可用高效液相色譜儀進(jìn)行精準(zhǔn)復(fù)核，提升檢測(cè)效率。日常檢驗(yàn)工作中，快檢儀和酶標(biāo)儀可為高效液相色譜儀提供輔助性檢測(cè)，相互補(bǔ)充，取長(zhǎng)補(bǔ)短，為精準(zhǔn)高效檢驗(yàn)嘔吐毒素共同提供數(shù)據(jù)參考。