高效液相色譜法測定熟肉制品中非法添加物 紅2G的不確定度評定

謝迎春，李擁軍，蘇玲玉，侯言東，駱 姍，張 琳

（1.甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730000；2.甘南州疾病預(yù)防控制中心，甘肅合作 747000）

紅2G ，又名食品紅10或酸性紅1，CAS號3734-67-6，國際編碼E128，屬于偶氮類合成色素，其顏色呈淺紅色，可在食物原有色澤基礎(chǔ)上添上桃紅色，甚至更深的血紅色，目前已有報道[1]測定紅2G的主要方法有高效液相色譜法（HPLC）[2-4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）[5-7]，由于該物質(zhì)被人體攝入后能夠分解出致癌物質(zhì)苯胺，可能誘發(fā)癌癥，所以在亞洲、歐洲[8]等地區(qū)的很多國家已經(jīng)明確規(guī)定禁止在食品中使用。但是在我國海關(guān)以及市面上發(fā)現(xiàn)依然有部分食品中違規(guī)添加紅2G的現(xiàn)象[9]，為更加精準地判定檢測結(jié)果，需要借助不確定度對其檢測過程中系統(tǒng)效應(yīng)和隨機效應(yīng)進行修正。

測量不確定度是實驗室中質(zhì)量控制的需要，能有效降低實驗過程中的風險因素，還可以反映結(jié)果正確性的可疑度，提高分析結(jié)果質(zhì)量和準確性，已普遍用于國內(nèi)外各類分析方法中[10-14]。根據(jù)目前有關(guān)紅2G的評估研究，還沒有發(fā)現(xiàn)對HPLC法測定熟肉制品中紅2G含量進行不確定度評定的報道。本研究參考CNAS-GL006-2019[15]、JJF 1059.1—2012[16]和JJF 1135—2005，對高效液相色譜法測定熟肉制品中紅2G含量的整體實驗過程進行不確定度評定，建立科學合理的數(shù)學模型，對實驗過程中不確定度來源進行分析，提高檢驗結(jié)果的準確性和科學性，為質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑材料

Acid red 2G（含量90%，不確定度：0.5%，BePure公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、乙醇、氨水、石油醚、檸檬酸、聚酰胺粉（200～400目）和乙酸銨（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；海砂（化學純，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.2 儀器設(shè)備

安捷倫1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；ME204E電子天平（感量0.1 mg，梅特勒-托利多儀器公司）；AB135-S電子天平（感量1 mg，梅特勒-托利多儀器公司）；3-30KS高速冷凍離心機（Sigma儀器公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

精確稱取紅2G標準品10.0 mg，用水溶解并定容至 10 mL容量瓶，配制成1 mg/mL的標準儲備液，取1 mL儲備液用甲醇定容至10 mL容量瓶，為100 μg/mL標準工作液，吸取標準工作液至10 mL容量瓶稀釋至標準系列濃度。

1.3.2 樣品前處理方法

樣品磨碎，取適量經(jīng)過沉淀蛋白、提取色素、脫脂、洗脫色素，收集調(diào)節(jié)pH，過膜上機[17-18]。具體實驗條件及過程較為復(fù)雜，在做不確定度評定時，統(tǒng)一歸納入樣品回收率不確定度評定。

1.3.3 樣品加標回收率實驗前處理方法

取0.1 mg紅2G標準加入樣品，做6組平行樣品，與樣品同時進行前處理，過膜及上機，取其中一個加標試樣重復(fù)上機測定6次。

1.3.4 儀器檢測條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：530 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度數(shù)學模型建立

高效液相色譜法測定熟肉制品中紅2G的計算公式為：

式中：X-樣品中紅2G含量，單位為mg/kg；C-由標準曲線計算得出樣液中紅2G的濃度，單位為μg/mL；V-溶液定容體積，單位為mL；M-樣品質(zhì)量，單位為g。

2.2 不確定度來源

從計算公式和實驗過程來看，熟肉制品中紅2G含量測定的不確定度主要來源分為3部分，即標準品、被測樣品、重復(fù)性。具體見圖1。

圖1 紅2G含量測定的不確定度的來源

2.3 標準物質(zhì)紅2G引入的不確定度u1

2.3.1 標準物質(zhì)配制引入的不確定度u1.1

（1）標準物質(zhì)純度引入的相對標準不確定度up。紅2G的標品純度為98%，其擴展不確定度為0.5%[19]，均勻分布，其相對標準不確定為：

（2）標準物質(zhì)稱量引入的不確定度um。標準品的稱量為10 mg，根據(jù)標準《電子天平檢定規(guī)程》（JJG 1036—2008）規(guī)定，天平校準不確定度為主要分量，其不確定度為0.05 mg，矩形分布，，則由標準物質(zhì)紅2G的稱量引入的相對標準不確定度為：

（3）標準物質(zhì)儲備液配制引入的不確定度uc。準確稱取10.0 mg標準品于10 mL容量瓶中，用水定容，此為1 mg/mL的標準儲備液。根據(jù)相關(guān)標準規(guī)定，10 mL容量瓶（A級）容量范圍為（10±0.02）mL，，則由容量瓶引入相對標準不確定度為：

另一方面是由于溫度波動引起的體積變化，標準《體積管檢定規(guī)程》（JJG 209—2010）中規(guī)定溫度波動范圍為（20±2）℃，取均勻分布，，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，相對標準不確定度：

10 mL容量瓶體積的合成標準不確定度uc為u1.1（V）和u1.1（t）的合成，則合成標準不確定度uc為：

因此，由標準物質(zhì)配制引入的總相對不確定度為：

2.3.2 標準物質(zhì)中間液配制引入的不確定度u1.2

用1 000 μL移液器移取1 mL標準儲備液（1.0 mg/mL）至10 mL容量瓶中，甲醇定容得100 μg/mL的標準中間液。其不確定度來自1 000 μL移液器和10 mL容量瓶。

（1）標準《體積管檢定規(guī)程》（JJG 209—2010）中規(guī)定溫度波動范圍為（20±2）℃，取均勻分布，，甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.2×10-3/℃，故溫度波動引起的體積相對標準不確定度為：

10 mL容量瓶引入的相對不確定度為：

（2）量程為1 000 μL移液器移取溶液，知其最大允許誤差為6 μL，，其相對標準不確定度為：

（3）溫度對于1 000 μL移液器體積的影響引入的不確定度為：

（4）由標準中間液配制引入的不確定度u1.2為：

2.3.3 標準曲線配制引入的不確定度u1.3

由于配制標準系列時移取不同體積的標準液，用到不同規(guī)格的移液器，u1.3為移液器引起的不確定度u1.3（E）、容量瓶引入的相對不確定度u1.3（R）和環(huán)境溫度變化引起的不確定度u1.3（t）的總和。

（1）標準工作溶液在配制過程中使用移液槍引入的相對標準不確定度見表2。按照矩形分布計算[20-21]，公式為：

表2 標準工作溶液配制過程中移液槍的不確定度

因此標準工作溶液配制過程中移液槍的使用引入的相對標準不確定度為：

（2）容量瓶的相對標準不確定度見表3。按照三角分布計算：

表3 標準工作溶液配制過程中容量瓶引入的不確定度

（3）標準溶液配制過程中溫度偏差引起的溶劑體積改變引入的相對不確定度u1.3（t）。甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.2×10-3/℃，其相對標準不確定度公式為，ΔT=2 ℃，環(huán)境溫度變化引入的相對不確定度見表4。標準溶液配制過程中溫度偏差引起的溶劑體積改變引入的相對不確定度u1.3（t）為：

表4 環(huán)境溫度變化引入的不確定度

（4）標準溶液配制過程中的合成相對標準不確定度u1.3計算為：

2.3.4 標準曲線擬合引入的不確定度u1.4

對標準工作溶液的6個點分別測定1次，得到相應(yīng)的色譜峰面積（表5），采用最小二乘法進行擬合，其公式為：

表5 標準溶液濃度與峰面積對應(yīng)表

式（2）中：p為樣品測定次數(shù)6，C0為樣品加標的平均濃度，為所有標準溶液的質(zhì)量濃度平均值。S為標準曲線的標準偏差，其中a為校準曲線斜率，b為校準曲線截距，n為標準曲線濃度點測定總次數(shù)6，xi為不同標準曲線濃度，yi為不同濃度對應(yīng)的峰面積。

由上述公式計算可得樣品測定中標準曲線擬合引入的不確定度，如表6所示。

表6 樣品測定結(jié)果和相對標準不確定度

2.3.5 標準物質(zhì)引入的不確定度u1

由標準物質(zhì)引入的不確定度u1為：

2.4 樣品前處理時產(chǎn)生的不確定度u2

2.4.1 樣品稱量引起的相對標準不確定度u2.1

用天平稱量10.0 g樣品，天平校準不確定度為主要分量，不確定度為0.5 mg，，樣品的稱量引入的相對標準不確定度為：

2.4.2 樣品加標回收率引入的相對標準不確定度u2.2

由于樣品前處理方法較為復(fù)雜，通過樣品加標回收率評定對整個過程的不確定度，結(jié)果見表7。

表7 加標回收實驗結(jié)果

回收率引入的標準不確定度為：

根據(jù)《測量不確定度表示指南》中要求，要校正明顯的系統(tǒng)誤差，故用t檢驗確定平均回收率是否有顯著性差異。

在95%置信概率下，t0.95（5）=2.447，t>t0.95（5），需要做回收率矯正。

2.4.3 樣品前處理過程引入的合成相對標準不確定度u2

樣品前處理過程引入的合成相對標準不確定度為：

2.5 測定時的重復(fù)進樣而引起的不確定度u3

將加標樣品進行6次（n=6）平行測定，平均值C0為 9.71 mg/kg，標準差為：，因此 重復(fù)測量引入的相對標準不確定度為：

2.6 標準不確定度的合成和擴展

高效液相色譜法測定熟肉制品中紅2G的合成相對不確定度的計算urel：取置信水平95%，包含因子k=2，則其擴展不確定度U=urel×k×C0，因此，熟肉制品中紅2G的擴展不確定度合成標準不確定度：U=urel×k×C0=0.056 5×2×9.71=1.097 mg/kg，結(jié)果表述為紅2G含量X=（9.71±1.097）mg/kg。

3 結(jié)論

本研究通過對高效液相色譜法測定熟肉制品中違禁添加物紅2G的不確定度各分量進行評定，由此建立一套合理、科學、完整的實驗分析方案，并且在結(jié)果表示中除去含量值，還應(yīng)包含不確定度[22-24]。從整個分析過程可以看出，最終檢測結(jié)果影響最大的分量主要來源于實驗過程中標準溶液的配制及擬合，其他分量引入的不確定度都相對較小。為保證檢測結(jié)果的準確性，在實際的檢測過程中，應(yīng)當定期維護、保養(yǎng)和檢定儀器，使儀器保持最佳狀態(tài)，并保持穩(wěn)定；配制標準時，首先選用純度較高的標準品，配制時使用精密度高的設(shè)備進行稱量及定容，提高曲線配制的準確度，通過線性范圍、重復(fù)次數(shù)等途徑降低誤差[25]，同時在實驗過程中采用多種質(zhì)量控制手段，以保證檢測結(jié)果的科學性和準確性，降低高效液相色譜法測定紅2G結(jié)果的不確定度。