吸水和干燥條件下發菜核糖體代謝差異表達基因分析

胡進紅，馬曉蓉，宋 繁，梁旺利，梁文裕，王玲霞

(寧夏大學 生命科學學院, 銀川 750021)

發菜(Nostocflagelliforme)是一種耐旱性極強的陸生固氮藍藻，分布在中國西北部干旱和半干旱的荒漠草原和荒灘戈壁等地區，生命周期中經歷交替的脫水和復水過程，具有生物固氮和拓荒固沙的重要經濟和生態價值[1]。由于人們的亂采濫挖，導致發菜資源逐年減少，發菜已被列為國家一級野生保護植物。目前，有關發菜在吸水和干燥條件下的結構變化、生理生態、基因和蛋白表達及蛋白修飾已有一些報道[2-3]，但有關發菜適應“干-濕”水分節律的分子機制尚有許多未解之謎。

核糖體蛋白可直接或輔助調節多肽鏈的合成以及執行核糖體外功能[4]。研究發現白三葉中多胺物質(PAs)下降從而影響核糖體蛋白表達下調是干旱脅迫適應性減弱的部分原因[5]。低溫和干旱脅迫下，水稻根和莖中核糖體蛋白RPL14基因的表達量均相應增加[6]，維持較高的核糖體蛋白積累與植物抗旱性的提高密切相關[7]。擬南芥根系中的同源基因會編碼不同的核糖體蛋白[8]，核糖體蛋白的磷酸化等修飾作用會改變核糖體的蛋白合成活性，從而適應環境脅迫[9]。

前人報道指出：斧形沙芥在重度干旱脅迫下，核糖體通路是差異基因富集的主要通路之一[10]。耐旱蠶豆中，50S核糖體蛋白在干旱脅迫下表達上調，推測其通過重建正常的蛋白質構象來保護植物免受干旱脅迫[11]。甘蔗核糖體蛋白基因也可在干旱脅迫下被誘導表達[12]。從茶樹抗旱性蛋白的鑒定中發現參與蛋白質加工(核糖體蛋白)、清除活性氧和防御蛋白質(超氧化物歧化酶、過氧化物酶和硫氧還蛋白)上調可能會增強植物對干旱脅迫的適應性[13]。核糖體蛋白是蛋白質合成的關鍵，在植物發育以及感知干旱脅迫等方面起著重要調節作用[14]。因此，植物核糖體代謝與干旱脅迫適應具有明顯的相關性，但目前干旱脅迫下核糖體蛋白基因的表達及相應調控機制研究較少，需深入研究和探討。

本研究采用高通量Illumina Hi Seq PE150測序平臺及生物信息學方法對發菜適應“干-濕”水分節律的差異表達基因進行篩選，解析發菜吸水和干燥條件下的核糖體代謝差異表達基因變化規律，為發菜適應“干-濕”水分節律的調控機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

發菜(N.flagelliforme)樣品采自寧夏賀蘭山自然生長地。將所采的發菜種植于模擬自然條件的培養床上，持續培養10 d后進行樣品處理(溫度23～25 ℃、濕度30%、光周期12 h/12 h、光照強度400 μmol·m-2·s-1)。充分吸水4 h的發菜為對照組A，自然失水48 h的發菜為處理組B(圖1)。每種處理組設置3次生物學重復。

A.充分吸水4 h;B. 極度干燥48 h; 下同圖1 吸水和干燥條件下發菜的形態變化A. Hydration for 4 hours; B. Dehydration for 48 hours. The same as belowFig.1 Morphological changes of N. flagelliforme subjected to hydration and dehydration

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及測序文庫構建發菜RNA的提取采用楊佳[15]優化后的天根試劑盒法，得到樣品RNA后構建cDNA測序文庫。使用Qubit 2.0初步定量文庫，稀釋至1 ng/μL的文庫的插入片段采用安捷倫2100進行檢測。使用定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)方法準確定量插入片段符合預期的文庫的有效濃度(文庫有效濃度>2 nmol/L)，以確保其質量達到送樣要求。

1.2.2 Illumina HiSeq測序及數據質量控制原始數據(raw reads)是通過高通量Illumina HiSeq PE150測序平臺對已構建好的文庫進行測序所獲得。將原始數據中帶接頭(adapter)的讀段(reads)、無法確定堿基信息比例大于10%的讀段(reads)和低質量讀段(reads)進行過濾處理，獲得干凈讀段(clean reads)。然后以已公布的發菜基因組(http://genome. kazusa.or.jp/cyanobase/NostocflagelliformeCCNUN1)作為參考基因組進行比對分析。

1.2.3 差異基因篩選在基因列表中，以CorrectedP-value ≤ 0.05且|log2(FoldChange)|>0為差異基因篩選標準進行差異表達基因篩選。

1.2.4 差異基因GO功能富集分析將篩選出的差異表達基因通過GO(Gene Ontology)進行功能富集分析，確定差異表達基因參與的生物學功能。

1.2.5 差異基因KEGG pathway分析將篩選出的差異表達基因通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進行Pathway顯著性富集分析來確定其參與的最主要的生化代謝和信號轉導途徑。

1.2.6 差異表達基因的qRT-PCR分析為了驗證轉錄組測序的數據，隨機選擇6個核糖體代謝差異表達基因進行實時熒光定量(qRT-PCR)分析，利用Primer5.0軟件設計引物(表1)。選擇16S-rRNA為內參基因，利用相對定量法進行表達量估算。

1.3 數據處理

采用Excel 2013對實驗數據進行整理和作圖，數據方差分析和多重比較使用SPSS 17.0軟件。

2 結果與分析

2.1 吸水和干燥條件下發菜轉錄組測序

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA質量。結果表明，發菜總RNA樣品電泳顯示出明顯的23S和16S條帶(圖2)。使用Agilent 2100檢測文庫的插入片段和核酸濃度測定儀測定結果表明，發菜提取的總RNA符合轉錄組測序送樣要求。

對樣品測序數據質量進行評估，每個樣本測序數據中，錯誤率≤0.03%，堿基G和C的含量占總堿基的45%左右，Q20和Q30均高于94%。測序數據質量具有較高的可靠性。

表1 qRT-PCR引物序列

以已公布的發菜基因組(http://genome. kazusa.or.jp/cyanobase/NostocflagelliformeCCNUN1)為參考基因組，對過濾后的測序序列通過Bowtie2進行基因組定位分析。所有樣本測序序列(Total Mapped Reads or Fragments)定位的百分比高于78.23%，其中具有多個定位的測序序列(Multiple Mapped Reads or Fragments)占總體測序序列的值低于17.11%。為了確保測序數據對基因表達的準確反映，需要對數據重復間的相關性進行分析。對發菜兩個不同樣本進行相關性檢測結果顯示，樣本間的相關系數均大于0.88(圖3)，表明測序數據可靠、樣本間重復性良好且變異不大。

M. DNA marker;1-3. 發菜A;4-6. 發菜B圖2 發菜總RNA電泳結果M. DNA marker; 1-3. A of N. flagelliforme; 4-6. B of N. flagelliformeFig.2 Electrophoresis image of total RNA of N. flagelliforme

A1-A3. 充分吸水4 h;B1-B3. 極度干燥48 h圖3 樣品相關性檢測結果A1-A3. Hydration for 4 hours; B1-B3. Dehydration for 48 hoursFig.3 Sample correlation test results

2.2 吸水和干燥條件下發菜基因的差異表達

根據差異基因篩選標準，對2個樣品進行兩兩差異基因統計分析，共篩選到差異表達基因3 383個。其中，與對照組相比，上調基因為1 767個，占總差異基因的52.2%；下調基因為1 616個，占總差異基因的47.8%(圖4)。

2.3 吸水和干燥條件下發菜差異表達基因的GO功能富集分析

對處理組中所有差異表達基因進行GO功能注釋富集分析(P≤0.05)，結果發現(圖5)，涉及生物過程中的12個顯著富集的GO條目中，差異表達基因主要富集于有機氮化合物代謝、蛋白質代謝、有機氮化合物生物合成、細胞蛋白質代謝、酰胺生物合成、肽代謝、肽生物合成和翻譯等過程；細胞組分類別中的10個顯著富集的GO條目中，差異表達基因主要富集在細胞組分、膜組分、細胞質、胞質組分、核糖核蛋白復合體和核糖體等功能；參與分子功能的6個顯著富集的GO條目中，差異表達基因主要富集在核糖體的結構組分、核苷酸轉移酶活性和作用于tRNA的催化活性等功能。結果表明，在干燥條件下發菜基因主要富集在蛋白質合成和代謝等相關代謝途徑中。

2.4 吸水和干燥條件下發菜核糖體代謝差異表達基因的KEGG Pathway富集分析

對處理組中所有差異表達基因通過KEGG pathway顯著性富集進行分析，選取顯著富集到核糖體代謝途徑的代謝通路(P≤0.05)，發現均為上調表達的46個差異表達基因(表2)。

2.5 qRT-PCR驗證核糖體代謝差異基因表達量

利用qRT-PCR技術對核糖體基因rplD、rplV、rplC、rplU、rpsB、rpsC在轉錄水平上的表達模式進行分析。結果表明，在干燥條件下，基因相對表達量較對照組均顯著增加(P≤0.05)，與轉錄組測序數據結果一致(圖6)。

圖4 發菜差異表達基因火山圖Fig.4 Differential gene volcano plot of N. flagelliforme

* 表示顯著富集圖5 吸水和干燥條件下發菜差異表達基因GO富集圖* is significant enrichmentFig.5 GO enrichment of differential genes in N. flagelliforme subjected to hydration and dehydration

圖6 吸水和干燥條件下發菜基因的相對表達量Fig.6 Relative expression of genes in N. flagelliforme subjected to hydration and dehydration

3 討 論

本研究通過GO功能富集分析和KEGG pathway富集分析發現，在吸水和干燥條件下發菜差異表達基因主要富集在蛋白質合成與代謝等相關途徑，并且核糖體代謝途徑被顯著富集(P≤0.05)。核糖體代謝途徑包含了均為上調表達的46個差異基因。經過qRT-PCR驗證發現，干旱條件下的核糖體代謝途徑的差異表達基因的表達量顯著增加。

植物通過新陳代謝的變化來適應環境信號，蛋白質合成便是其中之一[16]。核糖體是應激條件下的基本亞細胞結構，核糖體大亞基蛋白基因的上調可能會通過維持或改善核糖體的正常功能，從而維持蛋白質的正常合成[17]。核糖體蛋白是核糖體生物發生和蛋白質合成中不可或缺的物質。小麥的蛋白質組學研究顯示，核糖體蛋白在干旱條件下會發生顯著變化[18]。核糖體是一種復雜的負責合成多肽的核糖核蛋白復合體，含有大量的核糖體蛋白質組分，這些核糖體蛋白的合成協調對植物細胞應對干旱脅迫構成了重大的挑戰，其中，轉錄調控是植物核糖體蛋白基因調控的重要組成部分[19]。

前人研究發現，核糖體蛋白L4、L22輔助RNA形成多肽出口通道，且多肽出口通道主要由大亞基核糖體蛋白L19、L22、L23、L24、L31e組成，以上核糖體蛋白具有分泌和參與折疊新生蛋白的功能[20]。此外，有研究指出擬南芥種子萌發和幼苗早期對滲透脅迫和脫落酸的靈敏性可通過核糖體蛋白L24A調節擬南芥鋅指結構(atrzf1)突變體中的脯氨酸含量來改變[21]。核糖體蛋白L5是一個穿梭蛋白，在 5S rRNA核質轉運過程中起作用[22]。干旱、鹽和凍害脅迫對核糖體L5基因表達有一定的誘導作用[23]。蛋白質翻譯過程中核糖體蛋白L10、L11、L7/L12具有招募蛋白因子和激活GTP酶的作用[24]。UV-B輻射應激信號可能通過CKB1調控核糖體L10家族的表達來積極調節[25]。核糖體蛋白L44基因在煙草中過表達會提高對干旱脅迫的耐受性[26]。植物核糖體蛋白基因的表達在各種脅迫處理下的轉錄水平都發生了變化，如擬南芥的核糖體蛋白L23a[27]、煙草L3[28]等。本研究發現以上這些核糖體蛋白的相關基因在發菜干燥條件下都上調表達，說明這些基因和發菜的耐旱性關系密切。

表2 吸水和干燥條件下發菜參與核糖體代謝途徑相關差異表達基因

續表2 Continued Table 2

核糖體蛋白S21、S8、S2、S11和S7可作為解旋酶幫助聚合到原核生物核糖體上的mRNA解旋，調控肽鏈的合成[29]。有研究發現在擬南芥中核糖體蛋白S10在小亞基中具有非常重要的作用，缺失S10直接導致具有功能的核糖體數量減少[30]。細菌核糖體蛋白S1接近肽鏈合成通道附近，可以與核糖體蛋白S2、S3、S5、S6、S18等核糖體蛋白互作[31]。核糖體蛋白S6的修飾參與了擬南芥發育調節和對環境刺激的適應性，S6是翻譯效率和核糖體生物發生水平上的一個關鍵的蛋白翻譯調節因子[32]。擬南芥中的核糖體蛋白S21突變損害光合作用和葉綠體發育，并且對葡萄糖高度敏感[33]。比較蛋白質組學發現核糖體蛋白S5影響了光系統Ⅰ和Ⅱ蛋白以及質體核糖體蛋白的大量積累，而且葉綠體核糖體蛋白S5和PSRP2影響干旱脅迫中種子的萌發以及鹽脅迫中種子的生長[34-35]。此外，植物還可以通過高度動態的翻譯機制來應對干旱脅迫，這種機制與轉錄機制協同作用[36]。以上研究結果說明核糖體蛋白可以適當調控植物應對外界脅迫。在本研究中這些核糖體蛋白的相關基因在發菜干燥條件下也呈上調表達，說明這些基因的表達可能參與了發菜適應外界環境變化的調節。

因此，我們認為發菜在干燥條件下可能通過激活特定的基因來維持核糖體組分的完整性，有助于核糖體重構和選擇性翻譯，從而幫助抗旱相關的蛋白質的合成和正確折疊、并參與滲透調節作用等重要生理活動進而調控其對干燥環境條件的適應。